发酵工程

链霉菌所产生的药物
①氨基环多醇类抗生素，如链霉素，新霉素，卡那霉
素，越霉素等; ②含聚酮链结构的抗生素，如四环素，蒽环素等；
③聚酮链经取代、还原后的次级代谢产物，如大环内
酯类，安沙霉素类，聚烯类，聚醚类抗生素等； ④多肽类抗生素，如抗肿瘤多肽类, 糖肽类，β-内酰 胺类等； ⑤核苷类抗生素，如多氧菌素，杀稻瘟素等； ⑥其他抗生素，如氯霉素，林可霉素，新生霉素,磷霉 素等。
弗洛里(Howard Walter
Florey,1898 － 1968,英
国牛津大学), 澳 大 利 亚
病理学家， 1945 年与弗
莱明和钱恩共同获得诺 贝尔生理学和医学奖。
钱恩（Ernst Boris Chain,
1906－1979,英国牛津大学）,德
国生化学家，1945年与弗莱明和 弗洛里共同获得诺贝尔生理学和 医学奖。
DNA重组技术，1972年
青霉素, 1943年 二战
丙酮，丁醇 1913年 一战
Robert Koch, 1881年
4000年前
发酵技术可追溯到4000年 前。在距今 4000 多年前的中国 龙山文化遗址中就有盛酒用的 陶樽，在距今 4600 年前的古埃 及金字塔中，也发现了类似面 包的遗迹。 那时所有的发酵几乎都是 自然发酵，没有专业的发酵设 备。
以及经基因工程技术改造后的动植物细胞的培养。重 组 DNA 技术首先在大肠杆菌中成功， 4 年后，经重组 DNA 改造后的细菌用于了人体生长激素及人体胰岛素 的生产，随后，相继用于了干扰素、疫苗以及单克隆
抗体的生产等。这些就是第三代发酵工程产品。
总之，基因工程、
细胞工程、酶工程、发酵 工程等新技术的出现 ，为 传统的发酵工业带来了巨
这一时期的工业生产特点是实验室 规模上的简单放大，人们着重于工艺的 研究，而尚未形成严格的工程学科。
第一代 发酵工 程产品
第二代发酵工程产品
1928年亚历山大· 弗莱明从青霉菌中提取到了青霉 素，为抗生素工业的兴起奠定了根本的基础。 1939 年， 弗洛里和钱恩继续了弗莱明的研究，他们重新研究了 青霉素的性质、分离和化学结构，解决了青霉素的浓
影响辐射效应的因素
◆氧效应 较高的氧分压能提高X射线的效应，对紫外
线影响不显著；
◆光复活作用 经紫外线照射后的菌体细胞如暴露于可
见光下，其诱变或致死作用均会下降，这一现象称为
光复活作用。这是因为在适宜的光照下，微生物细胞 将损伤了的DNA进行了修复，从而削弱了诱变效果。 ◆许多药品对辐射的诱变和杀害效应有保护和消除作用。 如丙酮酸，琥珀酸等。
培养时间一般细菌、酵母、霉菌2-3天，放线菌5-7天。 6.挑取单个菌落保存或进行复筛。 7.得到纯种后保存，并进行理化性能的测定。
平板划线培养法
①将含有1.5%琼脂的固体无菌
培养基加热溶解后，注入无菌 培养皿中（厚度 2-3MM ）， 冷却至固化并放置一段时间， 使冷凝水自然蒸发后备用。 ②从预先稀释的检样液中取一 白金耳检样，由平板的一端开 始划制多条平行的曲线。 ③划线完成后盖上培养皿盖， 置于温箱中进行恒温培养。
种的目标，从无定向的突变株中，筛
选出具有某一优良性状的突变株。
诱变育种
诱变方法
物理诱变
化学诱变
物理诱变
1
诱变剂
2
紫外线 诱变机理
3
辐射剂量
4
影响辐 射效应 的因素
5
紫外诱 变处理 过程
物理诱变剂
物理诱变剂很多，有紫外线，X 射线， β 射线， γ 射线等。
电磁波
可见光 紫外线 X射线 γ 射线
大的推动力和崭新的活力。
§1. 细胞培 养
微生物 培养 动物细 胞培养 植物细 胞培养
由于生物产品都是从细胞得来，因此， 细胞培养技术是生物技术中最核心的技术。
一、用于微生物药物生产 的主要微生物
优良的微生物菌种是微生物药物工业生
产的基础和关键，要制造种类、质量优良的微生
物药物，首先必须选育性能优良的生产菌种。
60 年 代 初 期 ，许多国家兴起 开发菌体作为饲 料蛋白源，使发 酵工业尤其是发 酵设备的改进得 到了长足的发展 ，出现了喷射式 发 酵 罐 , 气 升式 发 酵 罐 , 循 环式 发酵罐等。
第三代发酵工程产品
1972年重组DNA技术和细胞融合技术的诞生，使
发酵工程从天然微生物扩展到人工构建的基因工程菌
抗生素 生产
酵母 生产
单细胞 蛋白生产
二战时期，1943年 具有通气搅拌的发酵罐 产生了，用于了青霉素 的生产，1944年链霉素 、1946年氯霉素等相继 发现并投产，成功地解 决了好氧微生物大规模 培养中氧的供应、培养 基和空气灭菌以及产品 提取中的关键技术和设 备问题。
1942-1943 年 ，在莫斯科、乌 拉尔及西伯利亚 相继建起了几十 家大型的酵母工 厂 ， 1942 年 列 宁 格勒被围困时， 进行了大规模的 酵母生产，使粮 食能够在城市中 生产，打破了敌 人的粮食封锁。
平板涂布培养法
1．将含有1.5%琼脂的固体无菌培
养基加热溶解后，注入无菌的
培养皿中（厚度 2-3MM ），冷 却至固化并放置一段时间，使 冷凝水自然蒸发后备用。 2 ．取预先稀释的检样液 0.1ml 置 于平板上，然后用无菌玻璃三 角刮刀在平板表面均匀地进行
涂布。
3．涂布完成后盖上培养皿盖，置 于温箱中进行恒温培养。
纯培养
1881 年德国细菌学家柯赫 （Robert Koch，1843－1910,德 国柏林传染病研究所）建立了单 种微生物的分离和纯培养技术， 为日后直到今天的发酵工程奠定 了根本的基础。 1905 年柯赫发表了控制结核 病的论文，并获得诺贝尔生理学 或医学奖。
1913 年，开始了丙酮丁醇的厌氧发 酵，尤其是第一次世界大战期间，由于 丙酮是生产炸药和飞机机翼涂料的原料， 英国首先建造了低碳钢发酵罐，以玉米 为原料大规模进行丙酮丁醇的厌氧发酵， 并在世界各地建立分厂。这个期间如乳 酸、面包酵母、乙醇、甘油、柠檬酸等 也相继投入生产。
紫 外 诱 变 的 处 理 过 程
④稀释 ① 斜面培养 ② 刮取菌苔 或孢子 ③ 制备 菌悬液 ⑤紫外线照射
⑥接种平板
⑦培养
⑧挑取单菌落
⑨扩大培养
性能测定
二、微生物菌种选育
自然界中蕴藏着大量的微生物， 这些微生物在生物生态上起着非常
重要的作用，有机物的分解、氮的
固定过程都离不开它们。 产生抗生素的微生物主要来源 于自然界土壤中。
1、菌种的分离、筛选
从存在于自然界的混合菌群里分离出一种微生物并加以 培养的过程叫做分离。 分离培养微生物的基本操作技术之一是“纯种培养”。
倾注平板培养法
1．将溶化后降温至 40-45℃的琼脂 固体培养基倒入到平皿中，迅速 加入 0.1ml 稀释后的检样液，轻
轻摇晃使之均匀混合，静置使之
凝固。 2 ．将凝固后的平皿置于温箱中进 行恒温培养。
2、微生物诱变育种
微生物诱变育种的原理
诱变育种就是利用物理、化学等诱
变因素，诱发基因突变，然后根据育
紫外线对DNA的效应： ①破坏了核糖（S）与磷酸（P）间的键联，使DNA链断裂；
②胞嘧啶（C）与鸟嘌呤（G）发生水合作用，造成氢链断裂；
③胸腺嘧啶（T）的二聚化作用： A.一条链上相邻的胸腺嘧啶发生二聚化作用，造成氢链断裂； B.两条链间的胸腺嘧啶发生二聚化作用，使氢键断裂。 上述这些变化，或是阻碍了DNA的复制，或引起了碱基排列次序的变 化，从而使基因发生突变。 在紫外线的诱变中，目前还不能控制DNA的哪一个部位起变化或引起 哪种特定的碱基排列次序的变化，因此决定了突变发生的无定向性。
青霉属
由青霉属产生的 微生物药物主要有青霉 素，灰黄霉素等。
曲 霉
由曲霉生产的最重要
的微生物药物是洛伐他汀， 是治疗心血管疾病的常用 药物。
粘细菌
粘细菌是一类能滑动的革兰氏阴性杆菌，
广泛地分布于土壤、腐烂植物和动物粪便中。 成千上万的细胞聚集在一起，形成粘孢子。 所产生的抗生素最受关注的是埃博霉素。 埃博霉素与紫杉醇有相似作用，对耐紫杉醇 的肿瘤细胞也表现出活性，是紫杉醇的更新 换代产品。
辐射剂量
辐射剂量以剂量强度与处理时间的乘积表示： 辐射剂量＝辐射强度×时间
ห้องสมุดไป่ตู้
辐射强度决定于辐射源的本质和辐射源与被处理物间
的距离。一般辐射源不变，距离不变，剂量与处理时间成 正比。 紫外线的剂量以15W紫外灯管照射的不同时间表示， 其作用剂量和诱变效应常常不呈直线关系。随着剂量的增 加，早期可提高突变率，当达到最高水平后，再增加辐射 剂量，突变率不会随之增加，甚至还会下降。因此，辐射 的剂量应先通过致死率剂量试验，根据细胞存活量来决定。
常用的分离培养基
微生物种类
细菌 放线菌
培养基
肉膏-蛋白胨 Waksman,甘油
酵母
霉菌 植物病原菌
麦芽膏
马铃薯，蔗糖 马铃薯
采土样
土样处理
稀释
微生物菌种的 分离筛选流程
单菌落
接种
培养分离
纯种
后处理
说 明
1.采土 将表面厚度约5CM的地表土去除，用取土器取深度5-15CM 之间的土样，编号、保存备用。 2.处理 3.稀释 将土样过筛，去杂，烘干等备用。 将土样用无菌水稀释1000-100万倍，充分振荡，使微生物分 散并游离在悬浮液中。 4.接种 吸取上述稀释液（或再做适当稀释）0.1-0.2ml，通过平板划 线、平板涂布或倾注平板法接入预先备好的培养皿中。 5.培养分离 按常规进行恒温培养，放线菌培养温度一般为28-30℃，
生产微生物药物的主要微生物
链霉菌属 假单胞菌属 芽孢杆菌属 青霉属
主要 微生物
曲 霉 粘细菌
链霉菌
链霉菌和链轮丝菌都属于放线菌，
革兰氏阳性，专性好氧，化学异养型，
以菌丝状生长，一般只需要一种碳源、
一种无机氮和少数无机盐就能够生长。 主要寄生在土壤中。 链霉菌是微生物药物生产的主要微
生物，它所产生的微生物药物主要有：
才能获得其目的产物。
①
②
③
④ ⑤
微 生 物 工 程 主 要 过 程
原料
配料
消毒 过滤
说 明 ①储备菌种或细胞系 ②活化 ③种子 ④一级种子罐 ⑤发酵罐 浓缩 结晶 洗涤 喷雾干燥 干燥 提取 废液 滤液 浓缩 菌体 或细胞
检测
包装
第二节 发酵工程的发展史
第三代产品 第二代产品 第一代产品 纯培养 自然发酵
假单胞菌属
革兰氏阴性，杆状，能够借助于鞭 毛运动，好氧，具有很强的降解有机物 的能力。
假单胞菌的许多性质都与它所携带
的大量质粒有关，所产生的微生物药物
一般是含氮的杂环化合物。
芽孢杆菌属
芽孢杆菌属是一类单细胞、杆状菌的 总称，好氧或兼性厌氧，当环境条件不利 时，会形成内生孢子。革兰氏阳性，一般 可以借助于侧生或有缘毛的鞭毛运动，通 常腐生在土壤中。 由芽孢杆菌产生的微生物药物一般都属 于多肽类。
缩问题，两年后制成首批青霉素。
1943年，青霉素被正式用于临床, 它的发现是人 类抗菌素历史上的一个里程碑，是二次大战中与原子 弹和雷达相并列的第三个重大发明。 1945 年，弗莱明 与弗洛里和钱恩共同获得诺贝尔生理学和医学奖。
亚历山大 · 弗莱明 （ Alexander Fleming, 1881-1955 ），苏格兰 生化学家。 1945 年 与 弗 洛 里 和钱恩共同获得诺贝 尔生理学和医学奖。
理想的菌种应符合以下基本要求：
菌种的基本要求
①所产生的产物疗效好，副作用小； ②遗传性状稳定； ③生长速度快，不易被其他微生物污染； ④目标产物的产量尽可能接近理论转化率； ⑤目标产物最好能分泌到细胞外，以降低产物抑制并有利于产 物提取；
⑥尽可能降低产物类似物的种类和产生量,以提高目标产物的产量 及有利于产物的分离； ⑦营养要求低，培养基成分简单，原材料来源广泛，价格低廉； ⑧对温度、PH、离子浓度等环境因素不敏感。
波长（nm）
400-700 13.6-400 0.06-100 0.01-0.14
不同电磁波的量子能量不同，波长越短，量子能量越高。因此， γ 射线＞X射线＞紫外线＞可见光。
紫外线的诱变机理
紫外线引起突变体的产生，主要是对DNA的作用。由于DNA对紫外线
有强烈的吸收作用，使DNA对紫外线十分敏感。
发酵工程
第一节 发酵工程及与生物工程的关系节 生物工程（生物技术）
基因工程
细胞工程
酶工程
发酵工程 (微生物工程)
发酵工程
利用生物体（主要是微生物，也包括 动物细胞和植物细胞）代谢过程中的酶系， 在最适条件下生产有价值产物的过程。 发酵工程是生物工程的核心和基础，
基因工程和细胞工程均需要通过发酵工程