糖类测定

1.糖蜜成分分析

1.1糖蜜中总糖、蔗糖及还原糖含量分析

1.1.1总糖含量的测定——苯酚-硫酸法

苯酚-硫酸试剂可与游离的或寡糖、多糖中的己糖、糖醛酸（或甲苯衍生物）起显色反应，己糖反应产物在490nm处（戊糖及糖醛酸反应产物在480nm）有最大吸收，吸收值与糖含量呈线性关系。

1.1.1.1 试剂：

浓硫酸(分析纯，95.5%)6%苯酚(临用前配制) 标准葡萄糖

1.1.1.2 实验方法与实验结果

①标准曲线的制定

准确称取标准葡萄糖20mg于500mL容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8mL，并以水补充总体积至2.0mL，然后加入6%苯酚1.0mL及浓硫酸5.0mL，静置10min，摇匀，室温放置20min后于490nm 测光密度，以2.0mL水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标

1

为光密度值，得标准曲线，如图

②样品含量测定

吸取样品液1.0mL，按上述步骤操作，测光密度，以标准曲线计算多糖含量。

③实验结果

表1 糖蜜中的总糖含量

甘蔗糖蜜524

甜菜糖蜜443

1.1.2 蔗糖含量的测定——Roe比色法

六碳糖与浓盐酸作用产生羟甲基糠醛，但酮糖比醛糖产生的羟甲基糠醛的量要多得多（1-1.5%酮糖与20%醛糖所产生的轻甲基糠醛量相等）。此羟甲基糠醛在一定条件下和酚类化合物一间苯二酚形成鲜红色。此反应在一定条件下为酮糖所特有，所以可作为酮糖测定的依据。样液中若同时存在果糖、葡萄糖或麦芽糖等不影响蔗糖的测定。其测定范围在40-360μg。

1.1.

2.1试剂

A：间苯二酚溶液，0.1g间苯二酚用6mol/L盐酸溶液溶解后定容至100mL；

B：10mol/L盐酸，量取83.5mL浓盐酸（比重1.19）注入蒸馏水中，并稀释到100mL，冷却；

C： 2mol/L氢氧化钠，准确称取8.0g氢氧化钠，用蒸馏水溶解后定容至100mL；

D：蔗糖标准溶液（1mg/mL），精确称取0.1g恒重蔗糖（90℃烘至恒重），以蒸馏水溶解并定容至100mL。

1.1.

2.2标准曲线制作

先用蒸馏水把1mg/mL蔗糖标准溶液稀释成0.4mg/mL蔗糖溶液，然后吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、0.9mL，分别加入试管中，再用蒸馏水使各管补足到0.9mL。此时，各管中含蔗糖量分别为0、40、80、160、240、320、360μg，各管中分别加入0.1mL 2mol/L氢氧化钠溶液（氢氧化钠最终浓度为0.2mol/L），混匀后在100℃沸水浴中加热10分钟，立即在流水中冷却。再加入间苯二酚溶液1mL，10mol/L盐酸3mL，摇匀后放80℃水浴中加热8分钟，冷却后在500nm 波长处测光密度值。以蔗糖含量(μg)为横坐标，相对应的光吸收值为纵坐标绘制标准曲线，如图2

图2 蔗糖标准曲线

1.1.

2.3实验结果

将糖蜜样液稀释一定倍数，使其中的蔗糖含量在40-360μg/mL。

取稀释后的糖蜜0.9mL，加入0.1mL 2mol/L氢氧化钠溶液，混合后在100℃沸水浴中加热10分钟，立即在流水中冷却。再加入间苯二酚溶液1mL，10mol/L 盐酸3mL，摇匀后放80℃水浴中加热8分钟，冷却后在500nm波长处测光密度值，以蒸馏水代替样品制成的空白做参比，在500nm波长处测吸光值，重复三次算其平均值。从标准曲线上查得相应的蔗糖含量，再通过计算得到糖蜜样液中的蔗糖含量。

表2 糖蜜样品中的蔗糖含量

甘蔗糖蜜391

甜菜糖蜜402

1.1.3 还原糖含量的测定——3,5—二硝基水杨酸比色法

还原糖测定方法甚多，糖厂常用兰-艾农法和兰-艾农恒容法测定废糖蜜中还原糖，此法需要注意煮沸时间的准确控制，从糖液全面沸腾时开始计时，显色剂四甲基蓝必须按规定量加入，而且滴定时锥形瓶不要离开热源，以免空气进入瓶内使显色剂再被氧化而产生误差，同时由于废糖蜜本身的颜色使滴定的终点不易判断，为了减少实验的误差，选用其他方法代替。

1.1.3.1 3,5-二硝基水杨酸比色法的原理

根据单糖、双糖和多糖的溶解度不同的性质可以把还原糖和非还原糖分离开，再利用酸使没有还原性的双糖和多糖彻底水解成具有还原性的单糖，通过3,5-二硝基水杨酸试剂与还原糖的呈色反应，即可以分光光度法测定样品中还原糖和总糖的含量。多糖水解后，葡萄糖分子残基上加了一份水，因而在结果计算中须扣除已加入的水量，测定所得的总糖量乘以0.9即为实际样品中总糖量。

单糖都是还原糖，3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物，在过量的氢氧化钠碱性溶液中此化合物呈橘红色，在波长540nm处有最大的吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。

1.1.3.2试剂

A：1%葡萄糖标准液，精确称取90℃烘至恒重的葡萄糖1g，以蒸馏水溶解并定容到100mL，使成为1000μg/mL。

B：3,5—二硝基水杨酸试剂，6.3g 3,5-二硝基水杨酸和262mL 2mol/LNaOH 加到酒石酸钾钠的热溶液中（182g酒石酸钾钠溶于500mL蒸馏水），再加5g苯酚和5g亚硫酸钠于上述溶液中，搅拌使其溶解。冷却后以蒸馏水定容到1000mL，贮于棕色瓶中。

1.1.3.3标准曲线制作

取5支试管，分别加入1000μg/mL的标准葡萄糖溶液1、2、4、6、8mL，以蒸馏水补体积到10mL。得到一系列不同浓度的标准葡萄糖溶液，它们的浓度是100、200、400、600、800μg/mL。分别吸取上述不同浓度葡萄糖溶液0.5mL于5支试管内，另取1支试管加入蒸馏水0.5mL。于上述6支管内均加入0.5mL 3,5-二硝基水杨酸试剂并混合均匀。沸水浴加热5分钟后取出以流动水冷却，每管内再加蒸馏水4mL，摇匀。在分光光度计上于540nm处读取光吸收值。以葡萄糖含量（μg）为横坐标，相应光吸收值为纵坐标作出标准曲线，如图3