粗蛋白质的测定

6.25
克蛋白质
粗蛋白质测定最常用凯氏定氮法， 1833年由凯达尔（Kjlehl）首创， 1833年由凯达尔（Kjlehl）首创，至今仍广 年由凯达尔 泛应用于土壤，肥料，饲料，食品分析中。 泛应用于土壤，肥料，饲料，食品分析中。 我国现行的国家标准亦将此法列为饲料 粗蛋白质测定的法定方法。 粗蛋白质测定的法定方法。
将样品倒入 消化管
将称量纸放回天平， 将称量纸放回天平， 读取所显示的负值， 读取所显示的负值，即 为倒入消化管的样品重
操作注意事项
2.样品必须 2.样品必须 准确称重
而所加入的催化剂、 而所加入的催化剂、 蔗糖、 蔗糖、硫酸不必精确度量
尽量避免样品粘在消化管的管壁上
3. 消 化 时 ， 消 化 管应盖上管帽
长期以来， 人们用测定总氮量 的 长期以来 ， 人们用测定 总氮量的 总氮量 方法， 根据饲料中氮与蛋白质的比例 方法 ， 关系，推导出蛋白质的含量。 关系，推导出蛋白质的含量。 出蛋白质的含量
问题是，并非只是蛋白质才含氮， 问题是，并非只是蛋白质才含氮，还有一 些非蛋白质的化合物亦含氮（如核酸、生物碱、 些非蛋白质的化合物亦含氮（如核酸、生物碱、 氨基酸、酰胺、硝酸盐及铵盐等）。 氨基酸、酰胺、硝酸盐及铵盐等）。 所以，用测定总氮量反推出来的， 所以，用测定总氮量反推出来的，实际上 包括了纯蛋白质和非蛋白质含氮物（氨化物） 包括了纯蛋白质和非蛋白质含氮物（氨化物）
消煮过程会产生大量二氧化硫和三氧化硫， 消煮过程会产生大量二氧化硫和三氧化硫， 需在通风橱内进行消煮
消煮控制
消煮液呈现蓝绿色澄清后， 消煮液呈现蓝绿色澄清后，继续 加热至少半小时。 加热至少半小时。
氨 气
蒸馏
样品分解液加入NaOH， 样品分解液加入NaOH，在强碱性条件 NaOH 下蒸馏，氨逸出，全部被硼酸吸收。 下蒸馏，氨逸出，全部被硼酸吸收。
3.滴定 3.滴定
硼酸吸收氨后， 硼酸吸收氨后，用酸滴定 NH4HB4O7 +HCl + 5H2O NH4Cl +4H3BO4 测出样品含氮量， 测出样品含氮量，乘以氮与蛋白质 的换算系数6.25， 的换算系数6.25，计算粗蛋白质的含量 6.25
操作步骤来自百度文库
称样——消煮 消煮——蒸馏 蒸馏———滴定 称样 消煮 蒸馏 滴定
消煮时样品颜色变化： 消煮时样品颜色变化
黑色（稠糊状） 褐红色——黄褐色 黄褐色— 黑色（稠糊状）——褐红色 褐红色 黄褐色 —黄绿色 黄绿色——蓝绿色（澄清） 蓝绿色（ 黄绿色 蓝绿色 澄清）
铜在消化过程中的颜色
CuSO4+ C + H+ ------Cu2SO4(棕黑色)+SO2↑+CO2↑ 棕黑色)+SO Cu2SO4+2H2SO4 -----蓝色) 2CuSO4(蓝色) +2H2O+SO2↑
空白测定
以0.5克蔗糖代替试样，耗0.05mol/L 0.5克蔗糖代替试样， 克蔗糖代替试样 盐酸不应超0.3ml。 盐酸不应超0.3ml。 0.3ml
计算
(V2-V1)×C×0.0140×6.25 0.0140× CP(%)= (V’/V) W× (V /V) ×100%
重复性
CP（ 当CP（%） >25% 允许相对偏差 1% 10-25% 10<10% 2% 3%
1.称样 1.称样
准确称取样品0.5准确称取样品0.5-1克 0.5 40目筛 目筛） (过40目筛）
加催化剂 （K2SO4 6克， 0.4克 CuSO4 0.4克）
加浓硫酸12ml 加浓硫酸12ml
–
消煮时加入各试剂的作用
浓硫酸——分解有机物，使氨固定 分解有机物， 浓硫酸 分解有机物 为硫酸铵。 为硫酸铵。 硫酸钾或硫酸钠——增温剂，使硫 增温剂， 硫酸钾或硫酸钠 增温剂 酸沸点由317℃升至325-341℃。 酸沸点由317℃升至325-341℃。 317℃升至325 硫酸铜——作催化剂、指示剂。 作催化剂、指示剂。 硫酸铜 作催化剂 其他催化剂： （其他催化剂：Se,Hg,HgO,H2O2等）
原理
1.消化
在催化剂帮助下，用硫酸破坏有机物，使 在催化剂帮助下，用硫酸破坏有机物， 含氮物转化为硫酸铵。 含氮物转化为硫酸铵。 2CH3CHNH2 COOH +13H2SO4
——————
(NH4)2SO +6CO2 +12SO2 +16H2O
2.蒸馏 2.蒸馏
加入强碱并蒸馏， 加入强碱并蒸馏，使氨逸出 (NH4)2SO4+2NaOH 用硼酸吸收 NH3 +4H3BO4 ———— NH4HB4O7 +5H2O 2NH3 +2H2O +Na2SO4
半微量凯氏定氮蒸馏装置
4.滴定 4.滴定
以盐酸标准溶液滴定。 以盐酸标准溶液滴定。根据耗酸量及其 浓度，算出含氮量，进而推算粗蛋白含量。 浓度，算出含氮量，进而推算粗蛋白含量。 指示剂：甲基红—溴甲酚绿混合指示剂。 溴甲酚绿混合指示剂。 指示剂：甲基红 溴甲酚绿混合指示剂 终点颜色： 蓝绿色滴定至 滴定至灰红色 终点颜色：由蓝绿色滴定至灰红色 HCl标准溶液常用浓度： HCl标准溶液常用浓度： 标准溶液常用浓度 常量测定用 0.1mol/L 半微量测定用 0.02mol/L
在通风橱里消 化样品。 化样品。开始时用 小火， 小火，待泡沫消失 后加大火力。 后加大火力。
消煮液呈现澄清蓝绿色后， 消煮液呈现澄清蓝绿色后， 继续加热至少半小时
蒸馏和滴定的操作注意事项 （待续） 待续）
粗蛋白质的测定
蛋白质是评价饲料营养价值的重 要指标。 要指标。 蛋白质含量测定也就成为饲料质 量检测中具有重要意义的常规项目。 量检测中具有重要意义的常规项目。
蛋白质种类繁多，结构复杂， 蛋白质种类繁多，结构复杂， 精确的测定难度较大。 精确的测定难度较大。
但各种蛋白质都有其共同的特 点——含有一定比例的氮。 含有一定比例的
准确性检验
以硫酸铵代替试样进行测定， 以硫酸铵代替试样进行测定， 应测得其含氮量为21.19±0.2%. 应测得其含氮量为21.19± 21.19
操作注意事项
1. 以减量法准确称样： 以减量法准确称样：
将称量纸放在 天平上，然后回零 天平上，然后回零
于称量纸上称取适量 的样品，然后回零 的样品，然后回零
粗蛋白质——饲料中 饲料中 粗蛋白质 含氮化合物的总称，包括 含氮化合物的总称， 纯蛋白质和氨化物。 纯蛋白质和氨化物。
推算系数6.25的由来： 推算系数6.25的由来： 6.25的由来
资料中常见在粗蛋白质这一名词后加注 6.25） （N×6.25） 各种饲料蛋白质的含氮量由14.7~19.5%不等， 各种饲料蛋白质的含氮量由14.7~19.5%不等， 14.7~19.5%不等 平均为16%， 100克蛋白质平均含16克氮 克蛋白质平均含16 平均为16%，即每100克蛋白质平均含16克氮 16% 而每测出1克氮，意味着存在100/16克蛋白 而每测出1克氮，意味着存在100/16克蛋白 100/16 质，即 1克氮相当于