应用杆状病毒载体表达狂犬病病毒糖蛋白

应用杆状病毒载体表达狂犬病病毒糖蛋白Ξ罗廷荣1　源宣之2　金城俊夫2(1　广西大学动物科技学院,南宁530005;2　日本岐阜大学农学部兽医公共卫生学研究室)摘要　本试验利用杆状病毒载体成功地表达狂犬病病毒糖(G )蛋白。

从转染重组了日本动物用狂犬病病毒疫苗株RC HL 株G 蛋白基因的转移载体和野生型杆状病毒DNA 的Sf 9细胞中,分离出2个重组杆状病毒克隆。

应用印渍法和荧光抗体法(IFA )从重组杆状病毒感染的Sf 9细胞检出了狂犬病毒G 蛋白。

Sf 9细胞表达的G 蛋白与狂犬病毒RC HL 株感染NA 细胞的G 蛋白的分子量一致。

35个抗RC HL 株G蛋白的单克隆抗体均与重组杆状病毒感染的Sf 9细胞反应,表明表达的G 蛋白的抗原性没有发生变异。

表达的G 蛋白主要分布在Sf 9细胞的膜表面,形成类似环状的荧光,这种荧光与RC HL 株感染的NA 细胞的荧光相同。

关键词　狂犬病病毒;糖蛋白;重组杆状病毒中图分类号　S 852165911;S 8521655Expression of Glycoprote i n of Rab ies V irus Usi ng Baculov irus VectorL uo T ingrong 1　M inam o to N obuyuk i 2　K in jo To sh i o2(1　Co llege of A n i m al Sciences and T echno logy ,Guangx i U n iv .,N ann ing 5300052D ep artm en t of V eterinary Pub lic H ealth ,Facu lty of A gricu ltu re ,Gifu U n iversity ,Japan )Abstract In th is exp eri m en t w e have successfu lly exp ressed rab ies vivu s glycop ro tein (G p ro tein )u sing bacu loviru s vecto r .Tw o clones of recom b inan t bacu loviru s w ere iso lated from Sf 9cells ,in w h ich w as tran sfeted w ith DNA of w ild typ e bacu loviru s and bacu loviru s tran sfer vecto r in 2serted G p ro tein gene of RC HL strain u sed fo r p roducti on of an i m als rab ies vaccine in Japan .B y u s 2ing w estern b lo t and indirect i m m unofluo rescen t assay (IFA ),the G p ro tein of rab ies viru s w as detect 2ed from Sf 9cells w h ich w ere infected w ith recom b inan t bacu loviru s .T he G p ro tein in Sf 9cells ex 2p ressed by recom b inan t bacu loviru s show ed iden tical m o lecu lar w eigh t w ith that in NA cells infected w ith RC HL strain of rab ies vru s .T h irty five m onoclonal an tibodies (M A b s )again st G p ro tein of RC HL strain reacted w ith G p ro tein on the Sf 9cells infected w ith recom b inan t bacu loviru s ,indi 2cating that an tigen ic variati on of the exp ressed G p ro tein has no t been found .M ajo rity of the exp ressed G p ro tein ex ists on the su rface of Sf 9cells ,fluo rescence of the Sf 9cells fo r m ed a ring like w henit infected w ith recom b inan t bacu loviru s and w as dyed by IFA .T h is k ind of fluo rescence on the Sf9cells w as the sam e as that on NA cells infected w ith RC HL strain of rab ies viru s u sing IFA .Key works rab ies viru s ;G p ro tein ;recom b inan t bacu loviru s狂犬病毒的糖(G )蛋白有多种功能:刺激中和抗体的产生而诱导免疫保护、细胞融合性、与细胞表面受体结合、血球凝集和免疫溶解。

近年来,根据不同的目的,狂犬病毒的G 蛋白基因已在不同的载体系统被表达,其中包括大肠杆菌系统、酵母系统、禽痘病毒和牛痘病毒载体系统。

引人注目的是,第18卷　第4期V o l 118N o 14广西农业生物科学Journal of Guangxi A gric .and B i o l .Science 1999年12月　D ec .1999　Ξ第一作者:男,1962年生,博士,副教授。

收稿日期:19990402262广西农业生物科学第18卷　禽痘病毒和牛痘病毒载体表达的狂犬病毒G蛋白在欧洲已应用于野生动物的口服免疫,对野生动物狂犬病的控制取得了较好的效果,为狂犬病疫苗的开发提供新途径。

最近又发明了一种新的表达系统:杆状病毒载体。

该系统既能大量表达目的蛋白,又能保持原有蛋白的各种生物学特性。

本研究利用杆状病毒载体成功地表达了一个日本动物用疫苗株的G蛋白,并对其抗原性进行了测定,为狂犬病疫苗的开发提供新数据。

1　材料与方法111　细胞与病毒Sf9细胞培养在含10%胎牛血清(FCS)的TC100培养液中,野生杆状病毒和重组杆状病毒毒株分别培养在Sf9细胞上。

NA细胞培养在含10%FCS的Eagle′s氏基础培养液,用于狂犬病毒RC HL株的培养。

112　单克隆抗体根据先前的方法制备了35个针对狂犬病毒G蛋白的单克隆抗体(L uo等,1998),这些单克隆抗体用于测定表达的G蛋白的抗原性。

113　狂犬病毒G蛋白基因的克隆用Isogen(日本产)法从感染RC HL株4d的NA细胞上清中提取病毒RNA,经反转录和聚合酶链反应(R T PCR)合成G蛋白c DNA。

精制的c DNA经大肠杆菌DNA聚合酶大片段K lenow修饰后,通过T4DNA连结酶接合到质粒pU C19的Sm a 限制核酸内切酶位点上。

114　重组杆状病毒转移载体(tran sfer vector)的构建用限制核酸内切酶EcoR I和B am H I把狂犬病毒G蛋白基因从质粒pU C19上切断并分离纯化。

同时用EcoR I和B am H I来消化杆状病毒转移载体pVL1392并分离纯化。

然后通过T4连结酶把G基因连结到pVL1392上(pVL1392G)。

重组的pVL1392G用EcoR I和B am H I消化及一对G 基因特异性引物扩增,确认G基因的存在后,转化到E.co li DH5Α菌中大量复制和提纯后保存于80℃备用。

115　Sf9细胞的准备分别把含110×106个处于最佳生长状态的Sf9细胞2mL置315c m的塑料小平皿中均匀分布,经30m in静置后,细胞贴附在平皿上,待用。

116　重组杆状病毒的转染将致死性线状杆状病毒DNA1Λg和含G基因的重组杆状病毒转移载体pVL1392G5Λg加在一个015mL小管中,用灭菌超纯水稀释至8ΛL。

然后加入用灭菌超水稀释2倍的脂质体(li pofectin) 8ΛL,混合均匀,室温15m in静置后,接种到含115mL无血清培养液的Sf9细胞(110×106细胞 315mL小平皿),2615℃培养3d,收集上清液。

用这些上清液在Sf9细胞上作空斑试验,以选择重组狂犬病毒G蛋白的杆状病毒。

117　琼脂糖的调制预先将低融点琼脂糖用灭菌双蒸水配成3%,经微波炉融化后置37℃温箱。

含血清的TC100培养液同置于37℃温箱,待二者的温度调至37℃时,按琼脂糖∶培养液=1∶2的比例混合,置37℃待用。

118　重组杆状病毒的选择把转染后第3d的细胞上清液稀释成原液、101和102浓度,分别取100ΛL接种到贴附在平皿的Sf 9细胞上,经60m in吸附,除去病毒接种液,迅速加入2mL调制好的琼脂糖培养液,待琼脂糖培养液凝固后,再加入1mL含血清的TC100,2615℃培养3d后,加入用PB S配成0101%的中性红溶液1mL,染色过夜。

挑取透明的空斑,并悬浮于小量(014mL)的培养液,充分搅拌使病毒释放出来,低速离心,取上清液作系列稀释后进行空斑试验,纯化重组病毒克隆,然后大量培养高滴度的病毒液,作保存用。

图1　重组杆状病毒转移载体中狂犬病毒G 基因的酶切图谱F ig .1　I den tif ication of rabies v irusG gene i n reco m bi nan tbaculov irus tran sfer vector by restr iction endonuclease 11M arker ,ΚDNA Sty I21提纯G 基因Purified G gene 31重组转移载体pVL 1392G EcoR I BamH I R ecom binant transfer vecto rpVL 1392G EcoR I BamH I119　荧光抗体法(IFA )检测表达的狂犬病毒G蛋白重组杆状病毒感染的Sf 9细胞和狂犬病毒RC HL 株感染的NA 细胞用冷丙酮固定20m in ,晾干。

在37℃分别与35个抗G 蛋白单克隆抗体孵育1h ,PB S 洗涤3次。