误差分析及解决办法

1） 细菌内毒素标准品种类
➢细菌内毒素国际标准品
➢细菌内毒素国家标准品
➢细菌内毒素工作标准品 细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取
精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度 和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家 标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵 敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。
6、环境的影响
保温时间 保温温度
1）
将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查 用水稀释成2λ，进行鲎试验，然后分别放置于 25、28、31、34、37、41、43、46、49℃水浴保 温。实验中观察到凝胶形成的速度随着温度的升 高而加快，但到达49℃保温90min也未出现凝胶。
从实验可以看出，温度对鲎试剂的灵敏度 影响很大，保温温度在25～41℃之间，随着温 度的升高，反应速度也升高，41℃尚未达到反 应速度峰值，25℃ 时反应速度已相当快；在 41～46℃之间，温度对鲎试剂的灵敏度无明显 影响；达到49℃或更高温度时，随温度升高而 使酶蛋白逐渐变性，则鲎试剂被破坏，反应速 度反而降低。
应该特别注意，该规程明确规定最后冲洗玻璃器皿 必须“用蒸馏水冲洗，禁用纯化水冲洗。”有的客 户使用反渗透制备的纯化水冲洗试验用玻璃器皿， 结果试验中所有的阳性对
照都为阴性，复核鲎试剂灵敏度时试验结果误差较 大，这主要是由于纯化水和蒸馏水的质量不同所造 成的。因纯化水中存在的阴阳离子经250℃高温干烤 不能完全被破坏，这时不同的离子就产生对鲎试剂 酶反应抑制或增强的反应，为了保证试验结果的准 确性和检验报告的权威性，我们应该严格遵守操作 规程，用多效蒸馏水冲洗鲎试验用玻璃器皿。
2） PH值对反应速度的影响 常见现象：样品阳性不成立。源自相 对7.0活
鲎试剂与内毒素反应的最适宜pH 力
在6.5-8.0；pH ≤3 或≥10时，
酶活性受到抑制。
PH
PH对反应速度的影响:
影响酶原的激活；
影响酶分子的构象，过高过低的PH会改变酶的 活性中心的构象，或甚至改变整个酶分子的机构 使其变性失活。
保证鲎试验结果准确的必用措施
——试验误差分析
董光宴 工程师
一、实验注意事项 二、影响试验结果的因素分析
湛江博康海洋生物有限公司
一、试验操作注意事项
——2005年版《中国药品检验标准操作规程》P297细菌内毒素检查法
➢实验前，须用肥皂洗手，用75％酒精棉球消毒。 ➢在使用洗耳球、移液管取样时，应注意不要将 洗耳球中的气体吹入溶液中，以防止气体中的内 毒素进入供试液。
➢复溶0.5ml鲎试剂时，在旋涡混合器上点击1-3 秒，促进鲎试剂的溶解。
➢由于凝集反应是不可逆的，所以在反应过程 中及观察结果时应注意不要使试管受到振动， 以免使凝胶破碎产生假阴性结果。
➢进行干扰实验时，标准对照系列和含内毒素 的供试品溶液系列应同时进行，并使用同一支 细菌内毒素标准品。
➢在进行鲎试剂灵敏度复核、干扰实验和供试 品细菌内毒素检查时，各个实验中要求的对照 应同时进行，并在实验有效的情况才能进行计 算和判断。
➢在进行鲎试剂灵敏度复核、干扰实验和供试 品细菌内毒素检查时，各个实验中要求的对照 应同时进行，并在实验有效的情况才能进行计 算和判断。
二、试验误差分析及改进措施
鲎试剂质量及灵敏度标示值得的影响 细菌内毒素工作标准品效价及使用的影响 实验器皿的的影响 样品成份及理化性质的影响 实验员的影响 环境的影响
谢 谢!
目前我公司研究证明，已知能与鲎试剂发生反应的 物质有细菌内毒素和β-葡聚糖，而内毒素反应曲 线为S型特征曲线，β-葡聚糖反应曲线为经过0点 的斜线。鲎试剂的特异性差的另一种表现，是将其 它物质（如β-葡聚糖）判定为内毒素，错误将合 格药品判为不合格，造成制药厂直接经济损失。
鲎试剂反应机理图
判断假阳性的方法： 1、特异性鲎试剂法； 2、定量反应曲线分析法； 3、家兔模拟试验法。
2）
将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检 查用水稀释成2λ，进行鲎试验，37℃保温， 分别在10、20、30、40、50、70min时观察， 发现凝胶的形成状态随着时间的延长而坚固。
因此夏天室温较高，如果试验操作时间太长， 细菌内毒素与鲎试剂混合液不等进入反应仪 器反应已开始，实际反应时间超过1小时。由 于室温不同，冬夏季节、南北地区之间的操 作误差将会很大。即使在25℃准室温下操作， 操作时间拖得过长，细菌内毒素含量较高时， 测定误差也不会小。
2005年版《中国药品检验标准操作规范》278页— —细菌内毒素检查法“实验准备”规定：“将被 洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并烘干水 分后，置洗液中浸泡4小时，取出将洗液沥干，用 自来水将残余的洗液洗净，再用蒸
馏水冲洗干燥后置适宜的密闭金属容器中，迅速置 烤箱中，除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒 素。”
②只能取1ml的细菌内毒素检查用水复溶 细菌内毒素工作标准品。
③若使用的为细菌内毒素国家标准品，可 按其使用说明书中的方法将其稀释至规定浓度后 分装保存。若为细菌内毒素工作标准品，为一次 性使用。
4） 错误使用
有部分客户使用厂家生产的细菌内毒素来复核 鲎试剂的灵敏度，这是一种错误行为，更有甚 者使用厂家生产的细菌内毒素来交叉复核鲎试 剂的灵敏度，这是一种严重错误行为。
3） 内毒素标准品操作误差
正确 （易折点）错误
取细菌内毒素工作标准一支， 轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底， 再用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕， 用 75% 酒 精 棉 球 擦 拭 后 启 开 ， 防止玻璃屑落入瓶内。
注意：①只能在安瓿的易折点上部开启内毒素， 不能沿易折点开启，防止振荡过程中内毒素粘在 封口膜上。
——2010年版《中国药典》
2） 细菌内毒素标准品效价误差
细菌内毒素国家标准品与细菌内毒素工作标准品 之间或细菌内毒素工作标准品与细菌内毒素工作 标准品之间的生物效价存在一定的误差，用不同 细菌内毒素标准品复核同一批鲎试剂灵敏度时可 能 存 在 一 定 的 误 差 。 中 国 药 典 要 求 “ 当 λc 在 0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素 检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏 度。”试验结果只要在这合格范围内表示鲎试剂 标示灵敏度准确。
4 样品成份及理化性质的影响
β-葡聚糖样物质的影响 PH值的影响 金属离子和弱酸阴离子的影响 药物浓度的影响
1） β-葡聚糖样物质的影响
常见现象：假阳性。
鲎试剂的特异性系指在药品、生物制品和血液制 品中鲎试剂能准确测出被测物质内毒素的能力， 既不能造成样品内毒素的漏检，也不能将其它物 质错判为内毒素。
3 实验器皿的影响
器皿的计量管理（校正） 器皿的选择标准 器皿的正确处理
1） 器皿的选择标准
鲎试验对器皿的要求：刻度准确；内表面光 滑；易于清理。细菌内毒素检查实验不宜选用 注射器，最好使用经过校正的刻度玻璃吸管或 吸嘴。注射器刻度不精确，内壁磨沙面吸附内 毒素，而且要特别注意注射器针头引入的铁离 子对试验结果的干扰，故不宜选用注射器。
如果用量不大，使用频率不高，建议大家选用 本公司提供的一次性耗材。无热原耗材是一种在 此行业中被鉴定为无内毒素和β-葡聚糖污染的产 品，其中包括, 无热原试管、无热原移液器吸头。 这些产品可以给您的工作带来很大方便,另外，当 实验出现误差时可首先排除器皿方面的因素,很快 分析判断出误差原因。
2） 器皿的正确处理
故鲎试验时，供试品 pH 最好应预调和6.58.0 为好，必要时可用无内毒素的 HCl 或NaOH 稀 溶液调节 pH 值。美国、日本药局方以及中国药典 故2005版规定检品必须调节PH值6.0-8.0。
3） 金属离子和弱酸阴离子 离子对细菌内毒素测定结果影响较大，一方面
阳离子如Fe3+、Al3+强度较大会引起内毒素的聚集造 成内毒素局部浓度过高，同时还必须注意高价阳离 子（如Fe3+）的氧化性对鲎试剂酶反应具有强抑制作 用；重金属离子如Ag+、Cu2+、Pb2+可以使蛋白质变性 而使酶失活；另一方面鲎试剂必须在二价阳离子Ca2+、 Mg2+的参与下才能被激活形成凝胶反应。许多药物因 PH值≥10时，其中的阴离子会吸收鲎试剂中的 Ca2+、 Mg2+离子，使实验呈假阴性。
4） 药物浓度 1、10%葡萄糖注射液 2、白蛋白、小牛血清 3、医用透明质酸钠 4、中药类注射液
5 实验员的影响
操作时严格按操作规程进行，安瓿开启前应先用 酒精棉球擦拭曲颈部，用将颈部折断，防止碎玻 屑掉入安瓿内。在鲎试剂的溶解、样品的稀释及 加样时，取样均应准确。如果一人独立完成试验， 可先稀释配制好内毒素标准溶液和样品溶液，然 后开启复溶鲎试剂，最后加样，尽可能缩短鲎试 剂溶液暴露在空气中的时间（最好控制在15分钟 内）。
1 鲎试剂质量及灵敏度标示值得的影响
➢鲎试剂的质量：抗干扰能力，稳定性；
➢鲎试剂灵敏度标示值的准确性 。 鲎试剂灵敏度的误差 是否用细菌内毒素国家标准品标定？ 标示值是否准确？
2 细菌内毒素标准品引起的误差
细菌内毒素标准品种类 细菌内毒素标准品效价误差 细菌内毒素标准品操作误差 细菌内毒素单位表示误差 细菌内毒素标准品的错误使用