复旦大学生化课件噬菌体策略

裂解发育的2个时期
早期发育
从噬菌体DNA进入到复制开始。主要合成与DNA复制相关的酶 （DNA合成、重组和修饰的酶），导致基因组不断的复制和重组
晚期发育
从复制开始到细胞裂解释放出子代噬菌体。噬菌体颗粒的蛋白质 成分被合成（结构蛋白和装配蛋白）
噬菌体通常拥有保证使噬菌体DNA优先复制的功能基因 （复制起始或新的DNA聚合酶）； 噬菌体的mRNA被优先转录（改变RNA聚合酶的起始和 终止能力或更换RNA聚合酶） 噬菌体通常利用宿主的合成机器合成自己的蛋白质
cII 是溶源所必需 的，没有或者量不 够， λ都不能进行 溶原生长 cII 是建立溶源所 必需的，但维持溶 源是不需要的
细胞中cII的水平
与宿主蛋白酶的水平相关 HflA 和 HflB是两类消化cII 的蛋白酶（High Frequency of Lysogenization） 基因hflA 座位实际上编码3个基因，其中HflC 和 HflK 是消化cII 的蛋白酶 HflB编码的蛋白酶可以消化cII和s32 宿主细胞的蛋白酶水平与生长状态相关，营养丰富的细 胞蛋白酶水平高，饥饿的细胞水平低 与cII、cIII的基因剂量有关 感染复数（multiplicity of infection）10倍的细胞 cII半衰期可以长40～50倍 野生型的模糊噬菌斑由于不同的moi引起 诱导的不可逆性是由于原噬菌体的一份基因不足以重新 建立起溶原
裂wenku.baidu.com发育的基因表达
早期基因（early gene）：最初阶段必须依赖
宿主转录机构表达的基因（λ噬箘体中为早早 期immediate early gene） 中期基因（middle gene）获得早期基因编码 的调控蛋白后表达的基因（或称迟早期 delayed early gene） 晚期基因（late gene）中期基因编码的调控 因子控制的基因
早早期基因的表达
从启动子PR向右转录到tR1，可以表达 cro蛋白 cro蛋白有双重功能： 抑制阻遏物的合成（对裂解进行是必需的） 关闭早早期基因的表达（在裂解周期晚期已不需要） （cro在后面还要详细介绍） 从启动子PL向左转录到tL1，可以表达 N蛋白
pN是一个抗终止子，它作用在nut位点将允许转
溶原和裂解的相互转化
由裂解周期产生的一个噬菌体进入一个新的宿主
细胞后，或者会重复裂解周期，或者进入溶源状 态，这取决于感染的状态及噬菌体和细菌的基因 型 在诱导（ induction ）的过程中，原噬菌体被切 除下来，从而脱离溶源生存方式约束获得自由， 产生一个自由的噬菌体DNA，由此进行裂解旁路 噬菌体以何种方式繁殖是由转录调节来控制的
λ噬菌体的操纵子
早早期基因：PR、PL 迟早期基因：PR、PL 裂解晚期基因：PR、PL、PR’ 溶源晚期基因：PRE、PaQ、PI
溶源维持基因： PRM
3.1 λ噬菌体的裂解途径
λ噬箘体DNA进入一个新的宿主细胞后，裂 解与溶源以相同的途径启动 第一阶段是利用宿主的RNA聚合酶进行早早 期（immediate early）基因的转录 λ噬菌体只有两个早早期基因，各自独立地 由宿主RNA聚合酶表达 λ噬菌体的裂解级联反应建立在抗终止作用 基础上
在pN作用下，由PL的转录越



过终止子，形成了核酸酶的 靶位点sib sib首先被RNaseIII剪切， 接着核酸外切酶从3’→5’降 解mRNA sib是int基因下游的负调节位 点，降解由下游向上游进行， 故称为反向调节 sib突变是阻止了RNaseIII 识别靶位点，rnc-的突变具 同样效果 由PI的转录在tI终止，具终止 子结构的 mRNA稳定，可以 表达蛋白
2 溶源（lysogeny）
另一些噬菌体有两种存在方式：裂解和溶源 溶源的结果是原噬箘体整合到细菌基因组上，
并与细菌基因一起遗传 由于含有一个原噬箘体，溶源菌会对同样类型 的噬箘体产生免疫，一个细菌基因组只包含一 个拷贝的同一类型的原噬箘体 有两种策略的噬菌体可以进行溶源和裂解生活 周期的交替
CII激活的转录
PROMOTER
PRE
SEQUENCE
TTGC GTTTGT TTGC <-- 13 --> AAGTAT
PI PaQ
TTGC GTGTAA TTGC <-- 13 --> TGTACT
TTGC GAGCAC TTGC <-- 13 --> TAGTAT
conserved cII binding sites are shown in red; -35 sequences are in green; -10 sequences are in blue. 保守的cII 结合位点TTGC突变，将影响噬菌体建立溶原的能力
PRE晚期表达
由cII激活的转录，从启动子PRE开始的转录 直接表达cI 细胞中有cI蛋白的积累，就可以通过与操纵基因OR的结合 激活自己的启动子PRM 因为从PRE 转录的mRNA 与cro的mRNA （从PR转录）有 一段反义（anti-sense）序列 ，由于编码区是双链RNA而 导致cro不能翻译，这属于反义控制（Antisense control）
裂解表达的级联控制
噬箘体基因位置组成（遗传图谱）反映了裂解进程的次
序，它的操纵子是一个极其有序的结构，编码相关功能 蛋白质的基因成簇排列使得调控最为经济，使得裂解的 进程能由少数的调控开关控制 裂解周期受到正调控，噬菌体的基因只有接受到恰当的 信号才被表达。在这个级联反应中，上个步骤合成的蛋 白质将是下一个步骤要表达的基因所必须的 在每个表达的阶段，一个或多个活跃的基因就是下个阶 段所需的调节因子，这些调节因子可以是一种新的RNA 聚合酶、改变宿主RNA聚合酶特异性的sigma因子、或 是能使之通读的抗终止因子
cII是溶源生长所需的转录激活因子，可以激活3个启
PR迟早期表达
动子 ：PRE、 PaQ 和 PI
cII不稳定，对蛋白酶敏感
cIII能够保护cII防止其降解
PL 迟早期表达
pN作用下的迟早期转录，从PL开始的转录表达cIII、 xis、int （ N蛋白不再介绍） cIII可以保护cII 蛋白
录过程进入迟早期基因 从启动子 PR’向右转录到 tR’ ，无任何编码序列
抗终止（antitermination）
抗终止作用提供了病毒控制从早期基因到下一期
基因表达转变的一种机制 抗终止作用依赖于基因位置的特殊安排：早期基 因与接下来要表达的基因非常接近，由终止子隔 开 如果终止子位点被抑制，聚合酶越过通读另一边 的基因，同样的启动子继续被RNA聚合酶识别 新基因的表达只在于伸长RNA链，使之在5′端含 有早期基因，在3′端含有新的基因 抗终止是正控制，病毒必须先合成早期基因的产 物，然后才能表达下一组基因
第四章 噬菌体策略
Phage strategies
一些概念
噬菌体（ bacteriophage ）：感染细菌的病毒（virus） 噬菌斑（plaque）：噬菌体裂解宿主细胞的斑 裂解感染（lytic infection）：细菌被噬菌体感染后致使


细菌死亡并释放出子代噬菌体 溶源（lysogeny）：噬菌体以原噬菌体形式成为细菌基 因组中稳定的组分而继续存活 原噬菌体（prophage）：噬菌体的基因组通过整合 （integrate）成为细菌线性染色体的一部分 免疫（immunity）：原噬菌体可以阻止同类其他的噬菌 体感染同一个细胞 诱导（induction）：原噬菌体通过诱导解除溶源化的限 制
cII蛋白（溶源中重点介绍） O & P蛋白：噬菌体复制所必需 Q蛋白：另一个抗终止因子，Q是晚期基因表达所必需的
PL迟早期表达
除了 N 蛋白，从PL 开始的早期转录本还表达：
cIII、xis、int蛋白（后面溶源中介绍）
裂解级联依赖抗终止
早早期

宿主RNA聚合酶从PL、PR起始转录N和 cro pN允许转录越过N和cro后继续，产生 pQ 从Q与S间的启动子PR’ 开始，如果缺少 了pQ，晚期转录将在 tR3位点终止，转 录产物194nt，为6SRNA pQ出现后，抑制tR3的终止，6SRNA 得以延伸 晚期基因的转录不在特定点终止，持续 转录所有晚期基因乃至走出这个区域 晚期基因左端的转录时也有相似的情形， 经过重组功能区后仍继续 每个方向上进行的转录可能在聚合酶撞 到一块前就终止了
抗终止依赖特定的位点
λ 噬菌体的pN能分别解除终止子tR1 、tL1等的
终止作用 pN的抗终止作用是高度特异性的，但抗 终止 事件并不是由终止子tR1 和tL1决定的 抗终止作用的识别位点在转录单位的上游，是 在与作用完成的终止子位点不同的其它区域 pN 识别位点：nut位点（N utilization site） nutL、nutR分别决定向左或向右抗终止作用
1 裂解周期（lytic cycle ）
有些噬菌体只有一种生存方式（strategy），在感 染了一个易感宿主之后，破坏了宿主的功能而同时 产生大量子代噬菌体颗粒，宿主细菌则裂解死亡 一个典型的裂解周期中，噬菌体 DNA （或RNA） 注入宿主细胞，其基因以一定的顺序转录，并且复 制出噬菌体的遗传物质，合成噬菌体颗粒需要的蛋 白质成分。最后宿主细菌裂解而释放出组装好的子 代噬菌体
nut位点
nutL在PL的起始点和N编码区域的开始
之间，接近于起始子 nutR位于cro基因的末端和tR1之间，接 近于终止子 qut位于起始子之前 这个作用涉及rho-依赖性终止子的抗终 止，但是pN也可抑制非依赖终止子的抗 终止作用
PR迟早期基因表达
从PR开始的迟早期（delayed early）转录本表达 转录一直到终止子tR3 ，除了 cro外还有
级联控制的2种途径
转录起始：识别新的噬菌体启动子，用一种σ 因子取
代宿主酶的σ 因子（spo1）或合成新的RNA聚合酶。 新σ 因子或RNA聚合酶生成后，早期基因表达可被终 止 抗终止作用：早期基因与下一期基因相邻，由终止位 点隔开。如果终止作用被阻止，RNA聚合酶便通读至 另一边基因，这样早期基因与晚期基因一起表达
迟早期

晚期


3.2 λ噬菌体的溶源途径
如果要在 E. coli 中建立溶源，λ噬菌体必 需做到：
合成阻遏物 噬菌体整合到宿主染色体上
既便噬菌体选择溶源途径，早早期基因的 表达与裂解途径相同
pN作用下的迟早期转录，从PR开始一直到终止子tR3 表达cII（其他蛋白在裂解中起作用，前面已介绍）
噬菌斑（plaque） 最初一个噬菌体感染一个
细胞，裂解释放的子代噬 菌体又感染旁边的细胞， 感染的连锁反应呈放射状 分布，逐渐形成一个噬菌 斑 烈性噬菌体形成清晰的噬 菌斑 温和的噬菌体形成浑浊的 噬菌斑
3 λ噬箘体的表达调控
λ（lambda）噬箘体基因组：48502bp 线性双链DNA 两端有12碱基的粘性末端（cohesive cos），进入细胞后变为环状DNA λ DNA环化后，晚期基因在转录时是完整 的 λ噬箘体基因组编码约35个蛋白质
噬菌体颗粒（particle） 感染（infection） 附着（attach） DNA被注射进细菌 早期发育（early development） 产生DNA合成酶类 DNA复制开始 晚期发育（late development） 产生基因组、头、尾 DNA包装进头，尾附着 裂解（lysis） 细胞破裂释放出子代噬菌体
cII单独存在的半衰期< 1 min； 有cIII时的半衰期 ~ 5 min
Xis一般认为是原噬菌体切除所必需的 Int一般认为是前噬菌体整合所必需的 值得注意的是，这里的xis和int由于sib位点的反向调 节（retroregulation ），并不表达出蛋白
反向调节（retroregulation）