可变剪接分析
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主要内容
可变剪接介绍 使用UCSC Genome browser分析 可变剪接成因分析 其它分析工具及数据库 基因表达谱
一、可变剪接介绍
可变剪接 (alternative splicing) 即一个 mRNA 前体通过不同的内含子去除方式可 以获得不同成熟mRNA 。
可变剪接示意图
可变剪接是生物多样性的重要成因
可变剪接的生理意义
可变剪接与基因表达的时空性息息相关， 在不同时期，不同组织基因的表达形式 可能不同，与物种发育的不同时期对应。
可变剪接的调控与生物体的健康息息相 关，其突变可以直接导致疾病。
1.1 可变剪接背景知识
内含子剪接信号
内含子剪接需要区分外显子及内含子，识别信 号主要包括 内含子5‘ 及 3’ 末端序列及中间 分支点（branch site）附近的序列。
1.3 可变剪接的调控
可变剪接的调控机制目前还不清楚。但 越来越多的研究表明，可变剪接的调控 是通过基因序列上的顺式作用元件和核 内反式作用分子的相互作用进行的。
可变剪接的调控
主要的顺式作用元件有：
– ESE: exon splicing enhancer 外显子剪接增强子 – ISE: intron splicing enhancer 内含子剪接增强子 – ESS: exon splicing silencer 外显子剪接沉默子 – ISS: intron splicing silencer 内含子剪接沉默子
反式作用因子
SR 蛋白
因富含serine/arginine 得名，该蛋白通常含有一至两 个RNA 识别模体（RRM，RNA Recognition Motif）， 羧基端有RS结构域（RS 二肽富集区）。 RRM负责介导RNA结合，决定各SR蛋白的底物特异性。 RS结构域主要参与蛋白-蛋白相互作用。
Genome Browser 简介
Genome Browser 可以理解为一个基因组的浏 览器，选择一定区域后，则会显示在该区域内 的一系列性质，如图谱信息（STS,FISH clone, chromosome band),定位在该区域的已知基因 情况以及通过基因预测软件预测的基因情况， 与该段基因组匹配的mRNA 与 EST信息，人 与其它物种如小鼠，大鼠，黑猩猩基因组的比 对情况等等，都直观的显示在一张图上。
1.2 可变剪接的主要模式
可变剪接主要有四种模式：
– 内含子不切割 – 5’或3’切点竞争 – 外显子跳过 – 外显子互斥
可变剪接的主要模式
内含子不剪切 外显子跳过
切点竞争 外显子互斥
可变剪接的结果
由于采用不同， 起到分子开关的作用。
二、可变剪接的分析
可变剪接的分析主要包括剪接体序列的 校正，剪接体之间的比较，以及剪接机 制的探索。
剪接体序列的校正
克隆试验得到的mRNA 往往不是全长， 测序反应也不能保证100%的正确，所以 拿到一条序列首先要对其进行校正，尽 可能保证使全长序列且无错误。
校正可以通过剪接体序列与EST数据及 基因组的比对进行。
剪接体序列的校正
与EST及基因组的比对可以到NCBI使用 BLAST进行，根据多数原则进行修正。 但这样做每次只能查看一条序列，没有 一个总体的概念。因此我们推荐使用加 州大学圣克鲁兹分校提供的Genome Browser 进行。
2.1 UCSC Genome Browser
Genome Browser 是美国加州大学圣克 鲁兹分校（University of California, Santa Cruz）开发的一套基因组注释浏 览工具。其特点是以基因组区域为单位 把相关注释信息整合在一个直观的界面 上。( )
内含子剪接信号
内含子5‘ 剪接点称为供体点（donor site）， 3’剪接点称为受体点(acceptor site)。
内含子开始和末尾的两对碱基最为保守，大多 数情况为 GU-AG (约占99.24%),少数为GCAG(约占0.7%), 极少数为AT-AC（0.05%)。除 了这两对保守碱基外，他们附近的碱基在不同 物种间存在差异，但在物种内有保守性。如如 脊椎动物5’剪接信号AG|GUAAGU 。
其它反式作用蛋白
其它如hnRNP蛋白，多聚嘧啶序列结合蛋白(PTB)， CELF蛋白家族等等也有各自不同的调节作用。
ESE 与SR 蛋白的作用模式可能是可变剪接调控中最 普遍的调控形式。已有实验表明由于外显子中剪接增 强子序列的突变不能与SR蛋白结合可以导致外显子的 跳过（exon skipping）。
剪接体分主要剪接体（major spliceosome） 和次要剪接体（minor spliceosome）。前者主 要针对剪接信号为GU-AG模式的内含子，包括 U1,U2,U4,U5,U6等亚基，后者主要对应ATAC模式，由另外一组亚基组成 。
剪接过程，U1结合donor site, U2结合 branch site, U4,U5,U6连结U1,U2
SR 蛋白
SR蛋白主要与外显子剪接增强元件ESE结合， 通过直接招募剪接体蛋白或是拮抗剪接抑制因 子的作用来发挥作用。
SR蛋白主要对5’位点的选择起作用： 通过招募剪接体蛋白如U2AF或是U1-70K，在 pre-mRNA的两个或多个5’可变剪接位点中促
进选择使用距内含子3’端较近的5’位点。
高等生物与低等生物的基因数量并没有特别显著 的差别，如人的基因估计约30000-40000，小鼠 的基因也为30000左右，而且人鼠基因有很多存 在有很高的相似性。果蝇、线虫等基因约为 15000，基因数量的差别不足以解释以上物种间 存在的显著差异。
可变剪接与蛋白质组
据估计，人40-60%的基因存在可变剪接形 式。通过可变剪接，产生多种蛋白产物， 放大了对不同物种基因组的差别，极大的 扩展了不同物种的变化空间。
内含子剪接信号
分支点（branch site）通常位于3‘剪接点 上游50bp,处于一段富含嘧啶的区域，分 支点腺嘌呤附近区域为YNYURAY 。
剪接识别信号
剪接体
剪接由剪接体（spliceosome）催化完成。剪 接体主要由几个核糖蛋白亚基组成，每个亚基 都由RNA链和蛋白组成。另外还有几十个小多 肽参与构成剪接体。
可变剪接介绍 使用UCSC Genome browser分析 可变剪接成因分析 其它分析工具及数据库 基因表达谱
一、可变剪接介绍
可变剪接 (alternative splicing) 即一个 mRNA 前体通过不同的内含子去除方式可 以获得不同成熟mRNA 。
可变剪接示意图
可变剪接是生物多样性的重要成因
可变剪接的生理意义
可变剪接与基因表达的时空性息息相关， 在不同时期，不同组织基因的表达形式 可能不同，与物种发育的不同时期对应。
可变剪接的调控与生物体的健康息息相 关，其突变可以直接导致疾病。
1.1 可变剪接背景知识
内含子剪接信号
内含子剪接需要区分外显子及内含子，识别信 号主要包括 内含子5‘ 及 3’ 末端序列及中间 分支点（branch site）附近的序列。
1.3 可变剪接的调控
可变剪接的调控机制目前还不清楚。但 越来越多的研究表明，可变剪接的调控 是通过基因序列上的顺式作用元件和核 内反式作用分子的相互作用进行的。
可变剪接的调控
主要的顺式作用元件有：
– ESE: exon splicing enhancer 外显子剪接增强子 – ISE: intron splicing enhancer 内含子剪接增强子 – ESS: exon splicing silencer 外显子剪接沉默子 – ISS: intron splicing silencer 内含子剪接沉默子
反式作用因子
SR 蛋白
因富含serine/arginine 得名，该蛋白通常含有一至两 个RNA 识别模体（RRM，RNA Recognition Motif）， 羧基端有RS结构域（RS 二肽富集区）。 RRM负责介导RNA结合，决定各SR蛋白的底物特异性。 RS结构域主要参与蛋白-蛋白相互作用。
Genome Browser 简介
Genome Browser 可以理解为一个基因组的浏 览器，选择一定区域后，则会显示在该区域内 的一系列性质，如图谱信息（STS,FISH clone, chromosome band),定位在该区域的已知基因 情况以及通过基因预测软件预测的基因情况， 与该段基因组匹配的mRNA 与 EST信息，人 与其它物种如小鼠，大鼠，黑猩猩基因组的比 对情况等等，都直观的显示在一张图上。
1.2 可变剪接的主要模式
可变剪接主要有四种模式：
– 内含子不切割 – 5’或3’切点竞争 – 外显子跳过 – 外显子互斥
可变剪接的主要模式
内含子不剪切 外显子跳过
切点竞争 外显子互斥
可变剪接的结果
由于采用不同， 起到分子开关的作用。
二、可变剪接的分析
可变剪接的分析主要包括剪接体序列的 校正，剪接体之间的比较，以及剪接机 制的探索。
剪接体序列的校正
克隆试验得到的mRNA 往往不是全长， 测序反应也不能保证100%的正确，所以 拿到一条序列首先要对其进行校正，尽 可能保证使全长序列且无错误。
校正可以通过剪接体序列与EST数据及 基因组的比对进行。
剪接体序列的校正
与EST及基因组的比对可以到NCBI使用 BLAST进行，根据多数原则进行修正。 但这样做每次只能查看一条序列，没有 一个总体的概念。因此我们推荐使用加 州大学圣克鲁兹分校提供的Genome Browser 进行。
2.1 UCSC Genome Browser
Genome Browser 是美国加州大学圣克 鲁兹分校（University of California, Santa Cruz）开发的一套基因组注释浏 览工具。其特点是以基因组区域为单位 把相关注释信息整合在一个直观的界面 上。( )
内含子剪接信号
内含子5‘ 剪接点称为供体点（donor site）， 3’剪接点称为受体点(acceptor site)。
内含子开始和末尾的两对碱基最为保守，大多 数情况为 GU-AG (约占99.24%),少数为GCAG(约占0.7%), 极少数为AT-AC（0.05%)。除 了这两对保守碱基外，他们附近的碱基在不同 物种间存在差异，但在物种内有保守性。如如 脊椎动物5’剪接信号AG|GUAAGU 。
其它反式作用蛋白
其它如hnRNP蛋白，多聚嘧啶序列结合蛋白(PTB)， CELF蛋白家族等等也有各自不同的调节作用。
ESE 与SR 蛋白的作用模式可能是可变剪接调控中最 普遍的调控形式。已有实验表明由于外显子中剪接增 强子序列的突变不能与SR蛋白结合可以导致外显子的 跳过（exon skipping）。
剪接体分主要剪接体（major spliceosome） 和次要剪接体（minor spliceosome）。前者主 要针对剪接信号为GU-AG模式的内含子，包括 U1,U2,U4,U5,U6等亚基，后者主要对应ATAC模式，由另外一组亚基组成 。
剪接过程，U1结合donor site, U2结合 branch site, U4,U5,U6连结U1,U2
SR 蛋白
SR蛋白主要与外显子剪接增强元件ESE结合， 通过直接招募剪接体蛋白或是拮抗剪接抑制因 子的作用来发挥作用。
SR蛋白主要对5’位点的选择起作用： 通过招募剪接体蛋白如U2AF或是U1-70K，在 pre-mRNA的两个或多个5’可变剪接位点中促
进选择使用距内含子3’端较近的5’位点。
高等生物与低等生物的基因数量并没有特别显著 的差别，如人的基因估计约30000-40000，小鼠 的基因也为30000左右，而且人鼠基因有很多存 在有很高的相似性。果蝇、线虫等基因约为 15000，基因数量的差别不足以解释以上物种间 存在的显著差异。
可变剪接与蛋白质组
据估计，人40-60%的基因存在可变剪接形 式。通过可变剪接，产生多种蛋白产物， 放大了对不同物种基因组的差别，极大的 扩展了不同物种的变化空间。
内含子剪接信号
分支点（branch site）通常位于3‘剪接点 上游50bp,处于一段富含嘧啶的区域，分 支点腺嘌呤附近区域为YNYURAY 。
剪接识别信号
剪接体
剪接由剪接体（spliceosome）催化完成。剪 接体主要由几个核糖蛋白亚基组成，每个亚基 都由RNA链和蛋白组成。另外还有几十个小多 肽参与构成剪接体。