分子标记辅助选择

第十七章分子标记辅助选择育种分子标记：以DNA多态性为基础的遗传标记分子标记的特点：1、遗传多态性高；2、在基因组中大量存在且均匀分布；3、稳定性、重现性好；4、信息量大，分析效率高第一节 分子标记的类型及原理一、分子标记的类型1、以DNA-DNA杂交为基础的DNA标记技术：限制性片段长度多态性标记，简称RFLP标记；可变数目串联重复序列标记，简称VNTR标记；原位杂交，简称ISH2、基于PCR的DNA标记：1）单引物PCR标记；2）双引物选择性扩增的PCR标记；3）通过克隆、测序来构建特殊双引物的PCR标记。

3、基于PCR与限制性内切酶技术相结合的DNA标记。

分为两类：限制性酶切片段的选择性扩增，如AFLP；PCR扩增片段的限制性酶切，如CAPs4、基于单核苷多态性的DNA标记：单核苷酸多态性，简称SNP二、主要分子标记1、RFLP（Restriction Fragment Length po1ymorpams）限制性片段长度多态性1980，Bostein用限制性内切酶酶切不同个体的基因组DNA后，含有与探针序列同源的酶切片段在长度上的差异。

（1）RFLP标记的原理基因组DNA序列上的变化：碱基替换、插入、缺失或重复造成某种限制性内切酶（restriction enzymes ）酶切位点的增加或丧失以及内切酶酶切位点间DNA片段变化（1）RFLP标记的分析步骤（2）RFLP分析探针单拷贝或寡拷贝探针来源：cDNA克隆；基因组克隆（Random Genome）；PCR克隆（3）RFLP标记的特点优点：①数目几乎无限；②共显性；③可以利用现有探针，具有种族特异性；④RFLP标记遍及全基因组；⑥重复性好缺点：成本较高;一个探针只能产生一个多态位点；需要许多克隆探针；所需DNA量大(5～15μg)；易造成环境污染2、RAPD（Random Amplification Polymorphism DNA）随机扩增多态性DNA1990,Williams通过PCR扩增染色体组DNA所获得的长度不同的多态性DNA片段。

如随机排列的寡聚脱氧核苷酸单链引物（ 10个核苷酸）。

PCR，聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）Mullis等(1985)PCR反应：变性、复性、延伸。

特异性取决于引物与模板DNA结合的特异性。

RAPD与经典的PCR反应的区别：①引物；②反应条件；③扩增产物AP-PCR（Arbitrarily primed polymerase chain reaction)：任意引物PCR；引物长度与一般PCR反应中的引物相当；开始阶段退火温度较低DAF（DNA amplification fingerprinting）：DNA扩增指纹；引物长度比RAPD更短，为5～8个核苷酸；DAF复性和延伸常用同一种温度（2）RAPD标记的特点优点：1）可检测未知序列的基因组DNA；2）引物无种族特异性；3）RAPD技术简单；4）单个引物可产生几个多态位点；5）通过克隆测序可转化成SCAR（特异序列扩增区域标记）；缺点：1）再现性差；2）显性遗传；3）存在共迁移问题3、AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphisms）扩增片段长度多态性1993， Zabeau marc和Vos pieter是对限制性酶切片段的选择性扩增。

（1）AFLP标记的原理：基因组的DNA进行双酶切；人工接头连接；PCR反应的引物；凝胶电泳限制性酶：酶切频率较高的限制性酶（frequent cutter），产生易于扩增基因组DNA。

酶切频率较低的限制性酶（rare cutter），限制扩增模板DNA片段的数量。

AFLP扩增数量由酶切频率较低的限制酶在基因组中的酶切位点数量决定。

AFLP分析的基本步骤：1）限制性核酸酶双酶切基因组DNA；2）DNA 片段两端连接上特定的接头；3）选择扩增；4）聚丙烯酰胺凝胶电泳；5）凝胶转移，干胶处理；6）自显影；（荧光标记、银染）（2）AFLP标记的特点优点：1）数目和种类很多；2）一次PCR反应可检测多个遗传位点；3）AFLP分析模板用量少；4）分辨率高；5）假阳性低，可靠性高；6）AFLP标记多数为显性；缺点：分析成本高；DNA的纯度及内切酶质量要求也比较高；甲基化敏感酶易产生假假阳性。

4、SSR（Simple Sequence Repeat）1987，Nakamura生物基因组内有一种短的重复次数不同的核心序列可变数目串联重复序列，简称VNTR（小卫星（minisatellites、微卫星（microsatellites）简单重复序列，又称微卫星：DNA一类由1—6个碱基组成的基序（motif）串联重复而成的DNA序列。

（1）SSR标记的原理：微卫星DNA两端的序列是相对保守的单拷贝序列。

根据微卫星DNA两端的单拷贝序列设计一对特异引物，利用PCR技术，扩增每个位点的微卫星DNA序列，通过电泳分析核心序列的长度多态性。

建立SSR标记的一般程序：①建立基因组DNA的质粒文库；②设计并合成探针，筛选重组克隆；③阳性克隆DNA插入序列测序；④根据SSR两侧序列设计并合成引物；⑤PCR扩增；⑥凝胶电泳检测（2）SSR标记的特点：1）数量几乎无限，检测出多态性的频率极高；2）检测一个单一的多等位基因位点。

3）多数为共显性标记；4）重复性高，稳定可靠；5）需DNA样品量少，对DNA质量要求亦不苛刻；使用SSR技术的前提是需要知道重复序列两翼的DNA序列。

ISSR标记：相邻SSR区域内的引物去扩增中间的单拷贝序列。

引物设计采用2－4个核苷酸序列为基序（motifs），以其不同重复次数再加上几个非重复的锚定碱基。

小卫星（minisatellites）标记：核心序列长度为10-60bp，常用Southern 杂交方法检测。

用小卫星做探针，与限制性内切酶酶切的基因组DNA杂交，检测其多态性。

5、SCAR（Sequence Characterized Amplification Region）特异序列扩增区域标记：一般步骤：RAPD分析；克隆片段两端测序；设计长为18～24bp的引物；PCR扩增检测优点、：高的重复性；共显性遗传6、CAPS（Cleaved Amplification Polymorphism Sequence-tagged Site）切割扩增多态序列标签位点技术，又称PCR-RFLP基本步骤：特定引物PCR扩增；PCR扩增产物限制性内切酶酶切；酶切产物凝胶电泳检测CAPs标记的优点：①引物与限制酶组合非常多；②CAPS标记呈共显性；③所需DNA量极少；④结果稳定可靠；⑤操作简便、快捷；7、STS（Sequence-tagged Sites）序列标签位点，简称序标位：指基因组中长度为200—500bp，且核苷酸顺序已知的单拷贝序列，可采用PCR 技术将其专一扩增出来。

引物来源：RFLP单拷贝的探针序列；微卫星序列；表达基因序列；YAC或cosmid插入末端序列8、表达序列标签（Expressed sequence tags ，ESTs ）表达基因的部分序列，突出优点：共显性遗传。

很容易在不同组合的遗传图谱间进行标记的转移，且是沟通植物遗传图谱和物理图谱的中介。

9、SRAP（Sequence-related amplified polymorphism）相关序列扩增多态性引物17-18个碱基，包括13-14个碱基的核心区域（5’的10-11个碱基为填充区，随后正向为CCGG，反向为AATT），核心区域后为3个选择碱基。

SRAP的特点：优点：1）每一反应可得大量多态位点；2）不需克隆任何序列，引物可用于不同生物；3）便利、简单；4）重复性好；5）PCR产物可直接测序。

10、SNP（simple nucleotide polymorphisms）单核苷酸多态性：等位基因遗传密码的单碱基差异。

基因组中每隔1000个碱基就存在一单碱基差异。

一般通过对PCR产物、基因组文库、表达序列标签（EST）文库测序而获得。

特点：数量大。

第二节重要农艺性状基因连锁标记的筛选一、遗传图谱的构建1、作图群体的建立（1）亲本的选配：亲本选择的原则：亲本间的DNA多态性丰富；亲本纯度高；杂交后代可育。

（2）群体的类型重组近交系群体（RIL ）：RIL群体是杂交后代经过多代自交而产生的一种作图群体，通常从F2代开始，采用单粒的方法建立。

常自交6-7代。

DH群体：单倍体经过染色体加倍形成的二倍体。

近等基因系群体：一组遗传背景相同或相近，只在个别区段存在差异的株系。

（3）群体的大小：构建分子标记骨架连锁图可用小群体150单株或家系。

2、图谱构建的理论基础：连锁图谱构建的理论是染色体的交换和重组。

重组型配子的最大比例为50% ，变化0-50%。

重组率可用来表示遗传图距，图距单位用厘摩（centi-Mergan, cM）表示，1cM的大小大致符合1%的重组率。

图谱制作的统计学原理1 两点测验：两位点存在连锁(r＜0.5)的概率与不连锁的概率(r=0.5)比。

概率之比可用似然比统计量来表示：似然函数L()L(r)/ L(0.5) log10L(r)/ L(0.5)=LOD 为确定两位点之间存在连锁，一般要求似然比大于1000，即LOD＞3；而否定连锁的存在，则要求似然比小于100，即LOD＜2。

②多点测验交换干涉与作图函数交换干涉:一个位置上所发生的交换会减少其周围另一个单交换的发生。

干扰的程度可用符合函数C表示。

C=实际双交换/ 理论双交换= 实际双交换 / R1R2作图函数：图距x与重组率间的关系。

Kosambi作图含数：X=(1/4)Ln(1+2r)/(1-2r)当r=0.2时，x=21.2cM。

3、标记基因型检测:检测作图群体的个体（株系）的分子标记基因型4、图谱构建软件:利用DNA标记数据，通过作图软件构建连锁图谱。

5、饱和DNA标记连锁图谱的制作遗传图谱的饱和度:指单位长度染色体上已定位的标记数。

染色体连锁框架图的标记间的平均间隔在不大于20cM；主基因定位标记间的平均间隔在10-20cM；一般QTL定位标记间的平均间隔在10cM以下；基因克隆标记间的平均间隔在1cM以下。

二、基因定位1、质量性状的基因定位（1）近等基因系分析（2）分离群体分组混合分析2、数量性状的基因定位：数量性状的基因座（QTL ）控制数量性状的基因（1） QTL定位方法1）基于标记的分析方法均值差检测法：检验同一标记不同基因型间数量性状均值的差异，若差异显著，则表明标记与QTL连锁。

性状标记回归法：将个体的数量性状表型值对单个标记或多个标记的基因型进行回归分析。