淋巴细胞增殖试验的标准操作规程

淋巴细胞增殖试验的标准操作规程（编号：035）
1、目的及适用范围
该SOP用来规范MTT法检测淋巴细胞转化效率的操作。

2、主要仪器
CO2细胞培养箱、普通光学显微镜。

超净工作台（生物安全级别）、电动吸引器、移液器、细胞计数器
3、试剂及配制方法
RPIM-1640培养基、淋巴细胞分离液、MTT噻唑蓝（5mg/mL用PBS，pH=7.4配制后，过滤除菌）
4、相关器皿的预处理
玻璃制品和金属制品高压灭菌
5、操作步骤
5.1分离小鼠脾细胞
5.1.1 断颈处死小鼠，浸入75%的乙醇中浸泡1-2min。

5.1.2 在超净台中用大头针固定，小心剪开小鼠的腹部外皮，再剪开小鼠的腹腔，用镊子取出小鼠脾脏。

注意无菌操作。

5.1.3 在60mm培养皿中放入4-5mL淋巴细胞分离液，用镊子把尼龙网固定在皿上。

然后用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使得分散的单细胞透过尼龙网进入淋巴细胞分离液中。

5.1.4 把悬有脾脏细胞的分离液转移到离心管中，然后覆盖上大约1mL的1640培养基。

5.1.5 800g离心30min。

离心结束后淋巴细胞会漂浮上来，在1640覆盖层下面聚集。

5.1.6 吸出淋巴细胞层，加入10mL 1640培养基洗涤一次，250g离心10min。

倾倒上清液，加入3-5mL含5%FBS的1640培养基重悬，细胞计数。

5.2接种细胞：用含10％FBS1640培养基配成单个细胞悬液，以每孔（1~8）×105个细胞/孔接种到96孔板，每孔体积200μL；
5.3培养细胞：同一般培养条件，培养1～2d（可根据试验目的和要求决定培养时间）；
70。