Biacore 动力学和亲和力实验的设计方法

物质迁移（Mass Transport）
在Biacore中，和动力学测量相关的一种现象 • 描述生物分子从溶液向芯片表面转移的过程 • 和生物分子间的相互作用无关
在Biacore中，所检测到的反应速率是物质迁移现象和分子间的 相互结合作用的综合结果 • 通过使用合适的反应环境，质量转移导致的影响能够被最大 程度地控制
(M-1s-1) (s-1)
koff
10-2 10-3 10-4 10-5
30 min 60 min
时间
4 / GE Title or job number / 2009-7-20
时间
用Biacore获得动力学和亲和力数据的2种方式
监测结合和解离速率 • 亲和力 动力学
监测稳态水平 •亲和力 动力学
12 / GE Title or job number / 2009-7-20
什么是物质迁移?
扩散的物质迁移 • 单一样品在静态的系统中
分析物 梯度
经过一定的时间，靠近芯片表面的分析物的浓度将会逐渐降低， 并逐渐在溶液中形成一个分析物浓度梯度
13 / GE Title or job number / 2009-7-20
同样的亲和力，不同的动力学
• •
所有4个化合物的亲和力数据相同 KD = 10 nM = 10-8 M 结合动力学常数可有不同数量级范围内的改变，本例中为4个数 量级
浓度 = 100 nM 浓度 = 1000 nM
所有靶位 点被占据
Response
kon
106 105 104 103
30 min 60 min
2 / GE Title or job number / 2009-7-20
动力学分析和亲和力分析的相关性?
细胞本身就是一个动态系统 – 极少处在平衡状态 同样的亲和力，不同的反应，动力学数据一般并不相同 • 动力学数据提供了更多的信息
3 / GE Title or job number / 2009-7-20
the equilibrium association constant [M-1] the equilibrium dissociation constant [M]
7 / GE Title or job number / 2009-7-20
Biacore中的平衡和动力学
A + B ⇔ AB
kd A 是溶液中的待分析物(analyte) • A的游离浓度由流动系统控制，在检测中保持恒定 AB 是结合复合物 • AB的浓度可通过直接检测RU得到，表示为R B 是偶联在传感芯片上的分子 • 总浓度能用 RU表示, 相当于最大结合反应理论值 Rmax • B的游离浓度即 Rmax-R ka
17 / GE Title or job number / 2009-7-20
必须考虑的几个因素
动力学分析
•试剂纯度
90%以上
•解离区域至少要超过结合量的10% •偶联水平
偶联量要低一些，使Rmax尽量控制在100左右，减少物质迁移的影响
•配体活性 •样品流速
不低于30ul/min
•偶联方法
18 / GE Title or job number / 2009-7-20
5 / GE Title or job number / 2009-7-20
1:1 动力学模型的速率方程
ka kd
ka kd [A] [AB]
A
Association: Dissociation:
Net rate equation:
d [AB] dt M/s
B
AB
A
[B]
B
d [AB] dt -d [AB] dt
我们无需知道复合物和配体的实际浓度！
8 / GE Title or job number / 2009-7-20
Biacore中的速率和亲和力
A
d [AB] dt ka
B
[A]
ka kd
[B]
AB
kd [AB]
dR dt RU/s
ka M-1s-1
C
M
[R max R]
RU
kd
R
s-1 RU
A has one binding site and reacts with immobilized ligand B has n identical and independent binding sites
亲和力和动力学基础知识
什么是动力学和亲和力?
动力学 • 反应发生的速度? – 与时间相关 • 结合 – 分子间结合的速度 • 解离 – 分子复合物解离的速度 • 动力学分析能够确定在一个给定的时间跨度内，分子复合物是否能够结合 还是完全解离 亲和力 • 分子间结合的强度? – 与时间无关 • 亲和力分析能够确定反应处于平衡状态（结合与解离形成动态平衡）时， 复合物的浓度
分析物浓度
动力学分析
•浓度应该覆盖所有范围的结合曲线（低浓度—饱和浓度）
至少5个分析物浓度
•设置至少一个浓度的样品重复 •设置零浓度样品
19 / GE Title or job number / 2009-7-20
总结
亲和力分析 • 获得亲和力平衡常数 • 适合分析结合和解离速度较快的相互作用过程 动力学分析 • 获得反应速率常数和亲和力平衡常数 • 对分子间相互作用的详细描述 • 具有相同亲和力数据的反应，结合和解离速率常数往往完全不同 • 对于了解生物学反应过程来说，获得反应速率常数往往比亲和力 分析更为重要
分析物的消耗和补充
流动相高度
1
扩散距离
2 3
1. 分析物由持续流动的样品所补充 2. 随着流速的下降，扩散效应会逐渐占据主导性、 3. 在配体/分析物表面发生的生物分子相互作用
14 / GE Title or job number / 2009-7-20
减少物质迁移的影响
• •
更低的 Rmax (ligand密度) 高进样流速
B A
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传感图中的变量和表示方式
10 / GE Title or job number / 2009-7-20
传感图中的信息
Rmax, Req 和 KD的关系
11 / GE Title or job number / 2009-7-20
B A
ka
M-1s-1
[A] M
[B] M
kd
s-1
[AB] M
where k a association rate constant [M-1s-1] k d dissociation rate constant [s-1]
6 / GE Title or job number / 2009-7-20
• •
高流速有效减少了扩散距离
可选的预设分析模式中已考虑了物质迁移效应
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亲和力和动力学测定的实验设计
实验设计
稳态实验--分析亲和力
• • • • • •
通过一系列不同的分析物浓度，确定达到稳态的结合水平 较高的偶联水平 浓度范围至少应该覆盖芯片表面的 20-80% 饱和度(RMAX) 设置对照芯片表面 设置至少一个浓度的样品重复 设置零浓度样品
平衡常数(Equilibrium constants)
At equilibrium: Association ka M-1s-1 [A] M [B] M Dissociation kd s-1 [AB] M
The equilibrium constants:
百度文库KA
KD
ka kd kd ka
[AB] [A] [B] [A] [B] [AB]