生物化学技术原理及应用

生物化学技术原理及应用

生物化学技术原理及应用

题型：

1.填空题：（0.5分／空，共20分）

2.名词解释：（2分／个，共10分）

3.判断题：（1分／题，共20分）

4.简答题：（10分／题，共50分）

第一章生物大分子物质的制备

一.相关概念：

1.抽提：用抽提液（常用缓冲液，稀酸，稀碱，有机溶剂例如丙酮，乙醇）进行反复萃取，将原料中有效成分最大限度分离出来的过程。

二.知识点：

1.理想抽提液具备：有效成分溶解度大，杂质不溶解或溶解度很小，来源广泛，价格低廉，操作安全。

2.影响有效成分抽提的因素：溶液PH（偏离等电点的稳定范围内）,离子强度（极性大在离子强度高，极性小在离子强度低），温度（低温0摄氏度时最稳定），搅拌（促使抽提物抽提液相互接触，增加溶解度，采用温和适中的速度，速度慢起不到搅拌作用，速度快产生气泡，使酶变性失活）氧化（氧化剂氧化分子与巯基导致失活，加入还原剂防止氧化），水解酶（蛋白受本身固有水解酶影响，加入抑制剂后使水解酶丧失活性），金属离子（蛋白与金属离子结合生成沉淀复合物，用无离子水或重蒸水配制试剂，配制试剂中加1～3mmol／L EDTA），抽提液与抽提物比例(5:1,抽提液过多有利于有效成分提取，不利于纯化程序。否则，反之)。

3.浓缩常用方法

沉淀法，吸附法，超过滤法，透析法，离心法，干燥法。

4.影响生物大分子保存的主要因素

空气（隔绝），温度（低温方面），水分，光线，样品的PH，时间。

第二章离心

一.知识点：

1.离心的基本原理：生物样品悬浮液在高速旋转下，在巨大的离心力作用下，离心力大于悬浮力，使悬浮颗粒以一定的速度沉降下来。

2.离心力表示方法：rpf

3.离心机的种类：普通离心机（转速小于1000），高速离心机，超速离心机（转速大于2000）。

4.离心机主要构件：转子，离心管

5.离心基本方法：沉淀离心，差速离心，密度梯度离心

6.离心机操作时注意: (1)转速设定，离心力>悬浮力／2。(2)对称于中心的两个离心管重量要平衡。(3)加样量勿超过3/4。(4)对于低温离心机要预先设置低温。(5)离心过程中注意听声音，看仪表。

第三章电泳技术

一.相关概念：

1.电泳：带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象。

2.电泳迁移率：带电粒子在单位时间内移动的距离叫电泳迁移率。

3.电渗现象：液体层相对于介质移动的现象。

4.两性电解质：所带电荷随着溶液酸碱度的变化而变化，酸性溶液中带正电荷，碱性溶液带负电荷。

5.印迹：将生物大分子凝胶转移到物像载体上。

二知识点：

1.影响电泳分离的主要因素

内因：分子量大小，分子形状，分子性质，带电荷量，分子直径。

外因：电场强度，溶液PH，溶液黏度，离子浓度，缓冲液性质。

2.琼脂糖凝胶聚合原理：依靠琼脂糖上的羟基，在聚合过程中，羟基与羟基上的氢键的聚合。

3.PAGE的组成，聚合原理及聚合方式

［1］组成：丙烯酰胺（单体）和甲撑双丙烯酰胺（双体交换剂）组成。

［2］原理：丙烯酰胺（单体）和甲撑双丙烯酰胺（双体交换剂）为材料，在催化剂作用下，聚合为含酰胺基侧链的脂肪族长链，在相邻长链之间通过甲撑桥连接而形成的三维网状结构物质。

［3］聚合方式：（1）化学聚合法：加入过硫酸铵，当丙烯酰胺，交联剂，四甲基乙二胺的水溶液中加入过硫酸铵，立即产生自由基，丙烯酰胺与自由基作用，随之活化。（2）光催化法：B2作为催化剂，光聚合过程在光激发下催化完成，核黄素在氧及紫外线作用下，生成含自由基的产物，与上述AP作用相同。

4.PAGE分离样品时的三种效应：浓缩效应，分离效应，电荷效应。

5.SDS-PAGE电泳(变性凝胶电泳)主要成分的作用：

（1）甘油或蔗糖：密度大，与样品结合，不发生漂样。

（2）SDS:与蛋白质结合，破坏高级结构，破坏氢键，去除蛋白质带电荷差异。

（3）巯基乙醇：破坏二硫键，使完整结构变松散。

（4）溴酚蓝：电泳指示剂。

6.等电聚焦电泳基本原理：小分子进入凝胶内部，流下时路程较长，而大分子物质却被阻排在外部，下来的路程短。

7.等电聚焦电泳的基本原理：蛋白质等电点不同，在同一PH下带电荷量不同从而进行分离。

8.2D－PAGE的操作顺序：先等电聚焦电泳，再SDS-PAGE.

9.Western blotting的操作步骤：（1）对蛋白质样品电泳分离（2）转膜（3）封闭（4）加入一抗与目的蛋白结合（5）加二抗（6）洗膜（7）膜的光分析。

第四章沉淀法

一相关概念：

1.沉淀：溶液中的物质由液相变成固相析出的过程。

二知识点：

1.制备蛋白质常用的沉淀方法

（1）.盐析法：中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性；加入中性盐后，破坏了水膜暴露出疏水区域；同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体。

（2）有机溶剂沉淀法：破坏蛋白质分子表面水化膜；降低水溶液的介电常数，增加蛋白质分子间的相互作用而使溶解度降低。

（3）蛋白质沉淀法

（4）聚乙二醇沉淀法：有机物与生物大分子发生共沉淀；使生物大分子脱水而发生沉淀；空间位置排斥将生物大分子挤在一起

（5）选择性沉淀法：根据各种蛋白质在不同物理、化学因子作用下稳定性不同的特点，用选择性沉淀法即可使杂蛋白变性沉淀，而欲分离的有效成分则存在于溶液中，从而达到纯化有效成分的目的。

（6）结晶沉淀法

（7）等电点沉淀法：等电点易形成沉淀析出，常与盐析法、有机溶剂沉淀法等配合使用。

第五章层析技术

一相关概念：

1.层析：以基质为固定相（呈柱状或薄层状），以液体或气体为流动相，使有效成分和和杂质在这两个相中连续不断，反复多次地进行分配或交换，吸附作用，最终达到分离混合物的目的。

2.固定相：位置相对不动，对样品产生保留的一项。它可以是固体物质，也可以是固定于载体上的液体物质；能与待分离的化合物发生可逆的吸附，脱吸附的过程。