第十四章PCR核酸扩增仪PPT课件
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PCR反应体系的组成:
引物 酶 dNTP 模板 Mg2+
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2020/9/29
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PCR 循环 – PCR技术的原理
第一步 – 加热变性
7
PCR 循环- PCR技术的原理
第二步 – 引物与模板DNA分子退火
8
PCR 循环- PCR技术的原理
第三步 - 引物延伸
9
PCR技术的原理
第1个 PCR 循环完成后 ——得到两个拷贝的靶序列
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PCR扩增时， Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解
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荧光基团和淬灭荧光基团分离
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❖ 每扩增一条DNA链，
就有一个荧光分子形成，
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PCR.swf原理flash
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❖ Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信 号到达设定的域值时所经历的循环数。
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Ct值与起始模板的关系
❖ 每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数 的对数存在线性关系，起始拷贝数越多， Ct值越小。
❖ 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标 准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的 对数，纵坐标代Ct值。
❖ 5.方便、快速、准确 FQ-PCR周期短，自动化程度高， 有非常严密的数学理论支持。
32
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第二节 PCR扩增仪的结构和工作原理
❖ 普通定性PCR扩增仪 ❖ 实时荧光定量PCR扩增仪
33
PCR扩增仪的工作原理
❖ PCR核酸扩增仪：利用PCR技术对特定基因做体 外的大量扩增
❖ PCR核酸扩增仪工作的关键是：温度控制
PCR反应的前15个循环的荧光信号作为 荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是 6-15个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍，即：
threshold = 10 × SDcycle 6-15
15
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Ct 值的定义
❖ 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要 的概念 —— Ct值。
❖ C代表Cycle，循环次数。t代表 threshold，阈或界限之意。
实时荧光定量PCR
29
实时荧光定量PCR的特点
❖ 1.特异性强
FQ-PCR具有引物和探针的双重特异性， 故与传统的PCR相比，特异性大为提高。
❖ 2.灵敏度高
灵敏度可达到102拷贝，线性范围可到达 102 －108拷贝。一般来讲临床标本中病 原体的数目为0-1010/拷贝。
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PCR技术的原理
循环数 扩增产物量 （2n）
1
21＝2
2
22＝4
3
23＝8
4
24＝16
5
25＝32
6
26＝64
20
220＝1,048,576
30
230＝1,073,741,824
30次循环后靶序列扩增的数量
11
实时荧光定量PCR技术原理
❖ 实时荧光定量PCR技术:实时荧光定 量PCR技术是在普通PCR技术基础上 增加了实时荧光指示系统。
34
PCR扩增仪的控温方式
控温方式
水浴锅控温
压缩机控温
半导体控温
离心式空气 加热控温
35
普通定性PCR扩增仪
❖ 按照变温方式分为以下三类：
水浴式PCR扩增仪 变温金属块式PCR扩增仪 变温气流式PCR扩增仪
36
普通定性PCR核酸扩增仪 ——水浴式PCR仪
一般由三个不同温度的水浴槽和机械臂组成。
30
荧光定量PCR的特点
❖ 3.重复性
FQ-FCR结果相当稳定，同一标本的 CT值相同，但其产物的荧光量却相 差甚大。因为域值设置在指数扩增 期，在此阶段，各反应组分浓度相 对稳定，没有副作用，CT与荧光信 号的对数呈线性关系。
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荧光定量PCR的特点
❖ 4.污染率小 全封闭的体系，有效地减小污染的 机率。
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Hale Waihona Puke 18因此，只要获得未知样品的Ct值，即 可从标准曲线上计算出该样品的起始 拷贝数。
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TaqMan荧光探针
❖PCR扩增时在加入一对引物的同时 加入一个特异性的荧光探针，该探 针为一寡核苷酸，两端分别标记一 个报告荧光基团和一个淬灭荧光基 团。
采用半导体传感技术、电子技术和计算机技术进行 水浴温度的测量、显示和控制
并经计算机控制由机械臂完成样品在每个水浴槽的 置放以及槽间的移动。
特点：变温快、时间准、温度均一，但仪器体积较 大，自动化程度低，控温不稳定，目前国内应用较 少。
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普通定性PCR核酸扩增仪 ——变温金属块式PCR仪
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❖ 探针完整时，报告基团发射的荧光 信号被淬灭基团吸收。
❖ PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶 活性将探针酶切降解，荧光基团和 淬灭荧光基团分离。
❖ 实现了荧光信号的累积与PCR产物 形成完全同步。
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注：探针完整时，报告基团发射的荧光信 号被淬灭基团吸收
在PCR反应体系中加入荧光探针 基团，利用荧光信号积累实时监测整 个PCR进程，最后通过标准曲线对未 知模板进行定量分析的方法。
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PCR反应体系的组成:
引物 酶 dNTP 模板 Mg2+
探针
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实时荧光定量PCR
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荧光域值（threshold）的设定
PCR 核酸扩增仪
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教学基本要求
❖ 掌握核酸扩增仪的分类和工作原理。 ❖ 掌握梯度PCR仪和原位PCR仪的功能和特点。 ❖ 掌握实时荧光定量PCR扩增仪的种类及特点。 ❖ 掌握PCR技术的原理；PCR扩增仪的种类；荧光实
时定量PCR（RQ-PCR）技术原理。
2
内容提要
第一节 PCR扩增仪工作原理 第二节 PCR核酸扩增仪的分类与结构 第三节 PCR核酸扩增仪的性能指标、操作规
程及常见故障的排除 第四节 PCR核酸扩增仪的临床应用
3
第一节 PCR核酸扩增仪的工作原理
❖ PCR技术的原理 ❖ 实时荧光定量PCR技术的原理
4
PCR技术的原理
❖ PCR技术的本质是核酸体外扩增
加热使双链DNA解开螺旋，在退火温度条件下引 物同模板DNA杂交，在Taq DNA聚合酶， dNTPs，Mg2+和合适pH缓冲液存在条件下延伸 引物，重复 “变性→退火→引物延伸”过程至 25～40个循环，呈指数级扩大待测样本中的核酸 拷贝数。
PCR反应体系的组成:
引物 酶 dNTP 模板 Mg2+
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PCR 循环 – PCR技术的原理
第一步 – 加热变性
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PCR 循环- PCR技术的原理
第二步 – 引物与模板DNA分子退火
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PCR 循环- PCR技术的原理
第三步 - 引物延伸
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PCR技术的原理
第1个 PCR 循环完成后 ——得到两个拷贝的靶序列
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PCR扩增时， Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解
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荧光基团和淬灭荧光基团分离
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❖ 每扩增一条DNA链，
就有一个荧光分子形成，
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PCR.swf原理flash
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❖ Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信 号到达设定的域值时所经历的循环数。
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Ct值与起始模板的关系
❖ 每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数 的对数存在线性关系，起始拷贝数越多， Ct值越小。
❖ 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标 准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的 对数，纵坐标代Ct值。
❖ 5.方便、快速、准确 FQ-PCR周期短，自动化程度高， 有非常严密的数学理论支持。
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第二节 PCR扩增仪的结构和工作原理
❖ 普通定性PCR扩增仪 ❖ 实时荧光定量PCR扩增仪
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PCR扩增仪的工作原理
❖ PCR核酸扩增仪：利用PCR技术对特定基因做体 外的大量扩增
❖ PCR核酸扩增仪工作的关键是：温度控制
PCR反应的前15个循环的荧光信号作为 荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是 6-15个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍，即：
threshold = 10 × SDcycle 6-15
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Ct 值的定义
❖ 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要 的概念 —— Ct值。
❖ C代表Cycle，循环次数。t代表 threshold，阈或界限之意。
实时荧光定量PCR
29
实时荧光定量PCR的特点
❖ 1.特异性强
FQ-PCR具有引物和探针的双重特异性， 故与传统的PCR相比，特异性大为提高。
❖ 2.灵敏度高
灵敏度可达到102拷贝，线性范围可到达 102 －108拷贝。一般来讲临床标本中病 原体的数目为0-1010/拷贝。
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PCR技术的原理
循环数 扩增产物量 （2n）
1
21＝2
2
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23＝8
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24＝16
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25＝32
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26＝64
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220＝1,048,576
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230＝1,073,741,824
30次循环后靶序列扩增的数量
11
实时荧光定量PCR技术原理
❖ 实时荧光定量PCR技术:实时荧光定 量PCR技术是在普通PCR技术基础上 增加了实时荧光指示系统。
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PCR扩增仪的控温方式
控温方式
水浴锅控温
压缩机控温
半导体控温
离心式空气 加热控温
35
普通定性PCR扩增仪
❖ 按照变温方式分为以下三类：
水浴式PCR扩增仪 变温金属块式PCR扩增仪 变温气流式PCR扩增仪
36
普通定性PCR核酸扩增仪 ——水浴式PCR仪
一般由三个不同温度的水浴槽和机械臂组成。
30
荧光定量PCR的特点
❖ 3.重复性
FQ-FCR结果相当稳定，同一标本的 CT值相同，但其产物的荧光量却相 差甚大。因为域值设置在指数扩增 期，在此阶段，各反应组分浓度相 对稳定，没有副作用，CT与荧光信 号的对数呈线性关系。
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荧光定量PCR的特点
❖ 4.污染率小 全封闭的体系，有效地减小污染的 机率。
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Hale Waihona Puke 18因此，只要获得未知样品的Ct值，即 可从标准曲线上计算出该样品的起始 拷贝数。
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TaqMan荧光探针
❖PCR扩增时在加入一对引物的同时 加入一个特异性的荧光探针，该探 针为一寡核苷酸，两端分别标记一 个报告荧光基团和一个淬灭荧光基 团。
采用半导体传感技术、电子技术和计算机技术进行 水浴温度的测量、显示和控制
并经计算机控制由机械臂完成样品在每个水浴槽的 置放以及槽间的移动。
特点：变温快、时间准、温度均一，但仪器体积较 大，自动化程度低，控温不稳定，目前国内应用较 少。
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普通定性PCR核酸扩增仪 ——变温金属块式PCR仪
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❖ 探针完整时，报告基团发射的荧光 信号被淬灭基团吸收。
❖ PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶 活性将探针酶切降解，荧光基团和 淬灭荧光基团分离。
❖ 实现了荧光信号的累积与PCR产物 形成完全同步。
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注：探针完整时，报告基团发射的荧光信 号被淬灭基团吸收
在PCR反应体系中加入荧光探针 基团，利用荧光信号积累实时监测整 个PCR进程，最后通过标准曲线对未 知模板进行定量分析的方法。
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PCR反应体系的组成:
引物 酶 dNTP 模板 Mg2+
探针
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2020/9/29
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实时荧光定量PCR
14
荧光域值（threshold）的设定
PCR 核酸扩增仪
1
教学基本要求
❖ 掌握核酸扩增仪的分类和工作原理。 ❖ 掌握梯度PCR仪和原位PCR仪的功能和特点。 ❖ 掌握实时荧光定量PCR扩增仪的种类及特点。 ❖ 掌握PCR技术的原理；PCR扩增仪的种类；荧光实
时定量PCR（RQ-PCR）技术原理。
2
内容提要
第一节 PCR扩增仪工作原理 第二节 PCR核酸扩增仪的分类与结构 第三节 PCR核酸扩增仪的性能指标、操作规
程及常见故障的排除 第四节 PCR核酸扩增仪的临床应用
3
第一节 PCR核酸扩增仪的工作原理
❖ PCR技术的原理 ❖ 实时荧光定量PCR技术的原理
4
PCR技术的原理
❖ PCR技术的本质是核酸体外扩增
加热使双链DNA解开螺旋，在退火温度条件下引 物同模板DNA杂交，在Taq DNA聚合酶， dNTPs，Mg2+和合适pH缓冲液存在条件下延伸 引物，重复 “变性→退火→引物延伸”过程至 25～40个循环，呈指数级扩大待测样本中的核酸 拷贝数。