细胞水平,蛋白水平,基因水平评估T细胞分泌IFN-γ

一、细胞水平

ELISPOT

原理：

本实验旨在测IFN-γ的分泌情况，T细胞受抗原刺激后分泌IFN-γ，同时被PVDF薄膜上特异抗体捕获。微孔盘中的细胞被移除并清洗后，被捕获的细胞激素可进一步使用生物素标记的二次抗体来标志，其后再以结合酵素的StreptAvidin与之作用，并加入酵素受质使其呈色，有反应作用的细胞会留下约10-20mm大小染色的斑点。

方法：

（1）获得PBMC

（2）IFN-γ诱导分泌：阳性对照品加入PMA，阴性对照不加刺激物。

（3）主要方法：处理PVDF孔板，在活化后预包被好抗体的平板中分别加入阴性PBMC及阳性PBMC，37℃孵育。第二天洗板后,加缓冲液后，孵育。清洗，加入稀释的检测抗体，孵育1小时, 洗板后再加入亲和素碱性磷酸酶再次孵育。最后加入BCIP/NBT显色，倒去液体，将板倒置以免残留的液体流回膜上一旦膜干燥后，4℃下放置一夜后读取点数，计算待测样本中IFN-γ的含量，从而评估T细胞的功能。

细胞内细胞因子染色

原理：

通过体外多克隆激活剂或特定的抗原激活T细胞，同时抑制IFN-γ释放到细胞外,使之在细胞质内蓄积，信号增强。增加细胞膜的通透性后，用抗细胞因子的抗体与胞内特定的分子相结合，通过非相关特异性同型匹配的抗体作为对照，以确定静止的与无细胞因子分泌的细胞的最小荧光背景，这样就可以用流式细胞仪检测不同细胞亚群分泌的细胞因子。

方法：

取T细胞，用PMA和Ionomycin同时刺激后孵育→→加入蛋白转运抑制剂继续培养→→细胞表面染色→→固定，破膜→→重悬细胞→→加入荧光标记抗体，避光→→缓冲液重悬，流式细胞仪检测→→结果分析

二、蛋白水平

ELISA

原理：

本实验所测T细胞分泌的IFN-γ有多个表位，采用双抗体夹心法来测含量，IFN-γ与酶结合后不改变其原有的特异性及免疫反应性，同时也不影响酶的催化效能。当存在相应的酶底物时，酶能催化产生有颜色的产物，颜色的有无和深浅可以反映IFN-γ的分泌情况。

方法：

(1)获得PBMC：将采集的静脉血置于肝素抗凝试管中,每份分别用等量RPMI1640培养液稀释，以淋巴细胞分离液分离PBMC。

(2)IFN-γ诱导分泌：阳性组每孔加入一定量ＰＨＡ，阴性组不加ＰＨＡ。细胞经37℃5%CO2,培养72h，2000rmp高速离心20min,取上清液。

(3)主要方法：用一抗包被，放置在反应板中4℃过夜。洗涤三次，将已知含量的IFN-γ标准品倍比稀释于各孔中，并设置阳性组、阴性对照组、空白对照组。加样后，孵育，洗涤。每孔加入酶，再次孵育，洗涤。加入底物后显色，读取OD值，绘制标准曲线。根据参考蛋白的含量计算待测样本中IFN-γ的含量，从而评估T细胞的功能。

Western blot

原理：

IFN-γ在本质上属于蛋白质，因此可以采用Western-Blot进行检测。经过SDS-PAGE分离后转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持原有的物质类型和生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

方法：

蛋白质样品获得→→制胶（1%琼脂糖封底；装配电泳槽；灌注分离胶；灌注浓缩胶）→→样品处理→→电泳→→转移→→免疫学检测（封闭过夜；一抗37°C 1h 洗3次；二抗37°C 1h 洗3次；底物显色5-15分钟；ddH2O洗涤）→→结果检测

三、基因水平

Northern blot

原理：

采用琼脂糖凝胶电泳，将分子量大小不同的RNA分离开来，随后将其原为转移至固相支持物（硝酸纤维素膜）上，再用放射性（或非放射性）标记的DNA或RNA探针，依据其同源性进行杂交，最后进行放射自显影（或化学显影），以目标RNA所在位置表示其分子量的大小，而其显影强度则可提示目标RNA在所测样品中的相对含量（即目标RNA的丰度）虽然Northern也可检测目标mRNA分子的大小，但更多的是用于检测目的基因在组织细胞中有无表达及表达的水平如何。

方法：

总RNA提取→→变性胶的制备→→样品制备→→电泳→→将RNA从变性胶转移到硝酸纤维素膜上→→转移完毕后，凝胶置紫外灯下，观察是否有残留RNA→→膜烤干保存→→探针的制备→→探针的纯化及比活性测定→→预杂交→→探针标记→→杂交→→洗膜→→压片暗盒中自显影→→去除膜上的探针

RT-PCR

原理：将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。对T细胞的总RNA进行抽提，以其中的mRNA作为模板，在Oligo（dT）逆转录酶作用下，把RNA反转录为cDNA，然后设计IFN-γ基因引物进行PCR，通过分析电泳条带灰度值，得出IFN-γ基因mRNA转录水平的相对量的变化，从而检测T细胞中IFN-γ表达水平。

方法：

T细胞总RNA的提取→→逆转录合成cDNA→→PCR反应→→PCR反应产物的电泳检测→→凝胶成像分析