几种差异表达基因筛选方法比较

Ｐ Ｒ扩增 ； ｈ Ｃ Ｚ ｕ等 采 用 Ｌ Ｐ Ｒ及 旋 转 柱层 析 法 Ｄ－Ｃ 对 其进 行 改进 ； ｏ 等 通 过 建 立基 于外 切 核 酸 酶 Ｌｗ ］ 的消减 杂 交法 克服 了消减杂 交对 起始 材 料 的需要 及
杂 交过 程 中 ＲＮａｅ的 污染 等 问 题 。但 消 减 杂交 的 ｓ 弊端也 较 显著 ， 先对起 始 材料 对照 组 ｍＲ 首 ＮＡ 的质 和量 要求 高 ， 难 获得 低 丰度 的差异 基 因 ； 很 同时经 羟 基磷 灰石柱层 析后 回收得到 的 ｅ ＮＡ量也很 低 ； 作 Ｄ 操
差 异基 因筛 选 的方 法 。 这 一方 法 的原 理 及 流 程 为 真 核 细胞 ｍＲＮＡ ３ 端有 一 个 由 ３ ￣３ ０个腺 苷 酸连成 的多 聚苷 酸 （ ｏ ０ ０ ｐ— ｌ＿ 尾 巴 ， ｙＡ） ３末端 与 ｐ ｌ 相 邻 的 ２个 碱 基 只 有 ｏｙＡ １ ２种 组合 。根 据这 一特 点 在 ３端 设计 １ ２种 锚 定 引
基 因 型在基 因表 达 上 的差 异 ， 离 并 克 隆 不 同组 织 分 或 同一 组织 不 同发 育 阶段 差 异 表 达 的基 因 ， 仅 是 不 研究 生 命过 程分 子 机 制 的 基 础 ， 是 进 行 功 能 基 因 也 组 学领 域研 究 的 前 提 。 因此 ， 寻找 差 异 表 达 基 因成 为 目前 基 因研究 的一 个非 常 重要 的 内容 。 目前 ， 选差 异表 达 基 因 的 方法 主要 有 差别 筛 筛 选技 术 、 消减 杂 交技术 、 ＮＡ 差 异 显示 技 术 、 因 ｍＲ 基 表达系列 分 析、 制性 消减 杂交 、 因芯 片技术 、 抑 基
复 杂 而精 源自文库 的网 络调控 过 程 。基 因的这 种差 异 表达
体， 以此 富集 Ｔｅｔｒ中特 异 的 ｃ ＮＡ， 本 质 是将 ｓｅ Ｄ 其 共 同拥有 的序列 消 减掉 ， 以富 集 目的基 因序列 ， 高 提 分离 的敏 感 性 。 消减 杂交 适 用 于 未 被克 隆 的基 因组 片段 ， 且 并 特别适 于 寻 找那些 由于缺 失造 成 突变 的基 因 。优化
分 离 出两类 同源分 子间差异 表达 的基 因。 消减 杂 交 原 理 及过 程 为 ： 来 源 相 似 而 功 能有 从 异 的两种 样 品获 得 ｍＲＮＡ， 有 目的基 因的 样 品 为 含
检 测 方 （ ｓｅ ） 不 含 目 的 基 因 的 样 品 称 为 驱 动 方 Ｔｅｔｒ ，
一
和 ３端 引 物 进 行 Ｐ Ｒ扩 增 。 因不 同 ｍＲＮＡ 扩 增 Ｃ 产 物大 小不 同 ， 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 电 泳分 离 ，通 过 经 自显影 或 荧 光 显 色 检 测 ， 得 平 行 材 料 间 的 差 异 获 ｃ ＤＮＡ 片段 ； 后 回收差 异 片段 、 最 扩增 、 隆 并 测序 、 克 用 Ｎｏ ｔ ｅｎｂｏ 检测 差 异 ｅ ｒｈ ｒ —ｌｔ ＤＮＡ 片段 是 否 为 阳性
录 ， 聚酶链 式反 应及 聚 丙烯 酰胺 凝胶 电泳 ） 合使 多 结
用 ， 以进行 两个 或 两 个 以上 样 本 之 间 的 差 异 基 因 可 表 达 比较 ； 其次 该 技 术 反应 灵 敏 ， 周期 短 ， 起 始 其 对 材 料要 求也 少 。 从 已发表 的相 关报 道 来 看 ， ｍＲＮＡ差 异显 示 技 术 尚 存 在 不 少 问 题 。首 先 就 是 假 阳 性 率 较 高
方 法 进 行 了归 纳 概 述 。
１ 消 减 杂 交 法
步骤 复杂 、 资 费时 、 复性 差 ； 耗 重 如果 基 因组过 大 ， 则 会导 致野生基 因组 和变异基 因组间 的杂交 复杂化 。
２ ｍＲＮＡ 差 异 显 示 法
ｍＲ ＮＡ 差 异 显 示 技 术 （ ｆ ｒｎ ｉｌ ｉｐａ ｆ Ｄｉ ｅｅ ｔ ｓ ｌｙ ｏ ｆ ａＤ
Ｃ ｉｅ ｅ ｏ ｒ ａ ｏ ｔ ｒ ａ ｙ Ｍｅ ｉｉｅ ｈ ｎ ｓ ｕ ｎ １ ｆ Ｊ Ｖｅｅ ｉ ｒ ｄ ｃ ｎ ｎ
ｍＲ ＮＡ差 异显 示技 术 最大 的优 势是 它 的简 便 。
它将 ３种 常 用 分 子 生 物 学 技 术 （ ｏｙＡ Ｒ ｐ ｌ— ＮＡ 逆 转
使靶 序 列 在 三 轮 杂 交 后 被 富 集 百 万 倍 以 上 ， 占 仅 Ｔｅｔｒ中 ０ ０ ０ 的 靶 序 列 也 可 以得 到 分 离 与 富 ｓｅ ．０ ５ 集 ， 时长 引物 （ ４ｍｅ） 高 退火 温度 （ ０ ７ 。 同 ２ ｒ及 ７ ℃／ ２ Ｃ）
Ｇｅ ｅＣ ｌｎ ｎ ａｌ ｇ技 术 等 。各种 方 法 广泛 应 用 于 动植 物 ｉ 差异 表达 基 因 的分 离 与 克 隆 。这 些 方 法 各 有 优 劣 ， 对 某 项具 体研 究 而 言 ， 择 合 适 的方 法是 十 分重 要 选 的 。本文 就此 对 目前差 异 表达 筛选 基 因 中几 种 主要
ＧＤ Ｇｅ ｏ ｃＤ Ｅ］ 这 些 技 术 在 克 服 Ｄ － Ｃ Ｄ（ ｎ ｍｉ Ｄ）ｌ ， １ ＤＰ Ｒ
后 的消减 杂 交可 明显 提 高富集 效率 。Ｄ ｇ ｉ ｕ ｕｄ和 Ｄｉ — ｎ ｕ ｒ３ 过 优 化 在 ｅ ＮＡ 后 加 接 头 进 行 选 择 性 ａ ｅ＿ 通 Ｄ
决 定着 每 一个 生命 体 的生 长发 育 、 化 、 分 细胞 周期 调 控 、 老及 死亡 等 生 命 过 程 。 比较 不 同细 胞 或 不 同 衰
医学 院 Ｖｅｃ ｌｓｕ等 口 ｌｕｅ ｃ 在 １ ９ 建立 的一 种 新 的 ９ ５年
基 因表 达转 录 组 （ｒｎ ｃｉｔｍｅ ） 析 技 术 。这 是 ｔａ ｓｒ ｏ ｓ 分 ｐ
一
个 以测 序为基 础 的定 量分 析 全基 因组 表达 模 式 的
Ｔ 。 Ｃ、 ｄ 简化 试 验 操作 ； ｄ Ｔ Ｇ， 通过 对 两端 引物 增 加碱 基 Ｃ ＧＧＡＡＴＴ ＧＧ 使 得 两端 都 带上 Ｅ ｏ 工 Ｃ ｃＲ 酶切 位 点 从 而 增 强 其 重 复 性 、 感 性 并 便 于 差 异 敏 Ｐ Ｒ产 物 克 隆＿ 。通 过 改 进 并 与 其 他 技 术 结 合 也 Ｃ ｇ ］ 产 生 了一 系列衍 生 技术 ， ０ 如 ＤＤ（ ｄ ｒｄＤ Ｄ］ Ｏｒｅｅ Ｄ） ｏ、
Ｃ ｉｅｅ ｏ ｒａ ｆ ｔｒ ａｙＭｅ ｉｎ ｈｎ ｓ ｕｎ ｌ ｅｉ ｒ ｄｃ ｅ Ｊ ｏ Ｖｅ ｎ ｉ
中 国兽 医 杂 志 ２ １ ０ ２年 （ ４ 第 ８卷 ） ６ 第 期
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几 种 差异 表 达基 因 筛选 方 法 比较
康 晓龙 ，李 新 海 ，冯登 侦
（ 宁夏 大 学 农 学 院 动 物 科 学 系 ， 夏 银 ＪＩ ５ ０ １ 宁 ７０２） Ｊ
物， 通式 为 ５一 ＭＮ－ Ｍ —Ａ， Ｇ； Ｔ ２ ３（ Ｃ， Ｎ—Ａ， Ｇ， Ｃ， Ｔ） ５端 有 ２ ， Ｏ种 １ ｐ长 的 随机 引物 。每组 引 物 锚 Ｏｂ 定 总 ｍＲＮＡ 的 １ １ 。锚 定 引 物 与 ｍＲＮＡ ３ 端锚 ／２
（ ｒ ｅ） Ｄ ｉ ｒ 。以 Ｏ ｉｏｄ ｖ ｌ －Ｔ为 引物 ， Ｔｅｔｒ中制备 放 ｇ 从 ｓｅ 射性标记的单链 ｅ ＤＮＡ 文 库 。然 后 将 这 些 ｅ ＤＮＡ
避 免 了引物 错配 问题 ＿ 此 外 ， 对 起 始 材 料 要 求 １ ； 其 低 、 期 短 、 感 、 事 ， 常 适 合 小 型实 验 室 开 展 。 周 敏 省 非 ｃ ＮＡ— ＤＡ也 存 在 明 显 不 足 ， 当 Ｔｅｔｒ靶 序 列 Ｄ Ｒ 如 ｓｅ 浓度较 低 时低 丰度 的分 子 富集 受 抑 制 ； 酶切 连 接 步 骤多 ，ＤＮＡ 会 损失 ， 能漏 掉 关键 基 因等 。 ｃ 可
大 于 ６ ０ｂ ０ ｐ的 片段 ， 上游 的差 异达 信 息得 不 到检 使 测 ， 能代 表真 正差 异表 达 的基 因 。随着 ｍＲＮＡ 差 不
异 显示 技 术 的推广 应用 ， 述缺 点也 不 断得 到改进 。 上
如 将 ３ 端 引 物 由 １ 条 改 进 为 ３ 条 ， Ｔ ｚ Ａ、 ２ 即 ｄ
收 稿 日期 ：０ １Ｏ 一８ ２ １一９Ｏ
定后 ， 逆 转 录 酶作 用 下 ， 转 录合 成 ｅ 在 逆 ＤＮＡ 的第 链 ； 后加 入 任 意 引 物 ，经 变 性 后 以 ｅ ＮＡ 第一 而 Ｄ
一
链 为模 板 ， 经过 低 温复性 造 成 任 意 引 物 与 ｅ ＤＮＡ 第 链错配 ， 之后 加入 Ｔ ｑＤ ａ ＮＡ 聚合 酶 ， ＮＴ ５ 端 ｄ Ｐ，
４ 基 因表达 系列 分析 技术
（ ０ ） 对高 拷 贝 的 ｍＲＮＡ 有 很 强 的倾 向性 ； ７ ［ ； 同 位素 放射 自显 影 安全 系数 低 ， 易造 成污 染等 ； 物组 引
合 数 多 ， 测 工 作 量 很 大 ； 能 扩 增 ｍＲＮＡ ３端 不 检 只
基 因 表 达 系 列 分 析 技 术 （ ｅｉｌＡｎ ｌｓ ｆ Ｓ ｒ ａ ｉ ｏ ａ ｙ ｓ Ｇｅ ｅＥｘ ｒｓｉｎ ＡＧＥ 是 由美 国 霍 普 金 斯 大 学 ｎ ｐ ｅｓ ，Ｓ ｏ ）
探 针 与 过 量 的来 自 Ｄ ｉｅ ｒ ｒ的 ｍＲＮＡ（ ｐ ｌ— 尾 ｖ 其 ｏｙＡ 已与 生物 素耦 联 ） 交 ， 两 轮充 分 杂 交 后 ， 杂 经 大部 分 单链 ｃ ＤＮＡ 探针 和 Ｄｒ ｅ ｉ ｒ中的 ｔＲ ｖ ｕ ＮＡ 形 成异 源 双 链 ， 过 羟 基 磷 灰 石 柱 层 除 去 ｃ ＮＡ ｍＲ 通 Ｄ — ＮＡ 杂 交
片段 。
作 者 简介 ： 晓 龙 （ ９ ２）男 ， 师 ， 士生 ， 事 动 物 遗 传 育 种 康 １ ８一 ， 讲 博 从
教 学 与 科 研 工 作 ， — ｉ ａ ｇ ｌ ｃｕ ｅｕ ｃ Ｅ ｍａ ：ｋ ｎ ｘ＠ ａ ．ｄ ．ｎ ｌ
６ ６
中国 兽 医 杂 志 ２ １ ０ ２年 （ ４ 第 ８卷 ） ６期 第
中图 分 类 号 ： ８ Ｑ７ 文献标识码 ： Ａ 文 章 编 号 ： ５ ９ ６ ０ （ ０ ２ ０ — ０ ５０ ０ ２ — ０ ５ ２ １ ） ６０ ６ — ３
生命 有机 体 在不 同发 育 时期不 同部 位 的基 因表
达具有 差 异性 ， 按 照 时 间 和 空 间顺 序 有 序 地 进 行 其
Ｒｅｃｉｎ Ｄ — Ｃ ） 由 Ｌ ａ ｇ和 Ｐ ｒ ｅ ｌ 于 ａｔ ，Ｄ ＲＴ Ｐ Ｒ 是 ｏ ｉｎ ａｄ ｅ ＿ ６
１９ ９ ２年建 立 的 以 Ｐ Ｒ 技术 和 聚 丙烯 凝 胶 电泳 技术 Ｃ 为 基础 ， 结合 银 染或 放 射 性 自显 影 等 显 色 技 术 进行
世纪 ６ ０年代 中期 由 Ｂ ｕｚ等＿ 用 于 纯化 噬菌 体 Ｔ ａｔ １ ］ ４
ｍＲＮＡ Ｒｅ ｅ ｓ Ｔｒ ｎｓ ｒｐ ｉ ｎ ｖ ｒｅ ａ ｃ ｉ ｔｏ Ｐｏ ｙｍｅ ａ ｅ ｌ ｒ ｓ Ｃｈａｎ ｉ
消 减 杂 交 （ｕ ｔ ｃｉ ｂｉｉ ｔ ｎ Ｓ 是 一 种 Ｓ ｂｒ ｔ ｅＨｙ ｒ ｚ ｉ ， Ｈ） ａ ｖ ｄａｏ 富 集 差 异 表 达 基 因 的 有 效 方 法 。这 种 方 法 最 初 在 ２ Ｏ
ｍＲ Ａ。２ 世 纪 ８ 年 代 中期 ， ａ ａ Ｎ ０ ０ Ｌ ｍ ｒ和 Ｐ ｌ ｒ＿ 经 ａ ｍｅ ２
过 对 前 人 技 术 的不 断完 善 ， 立 了新 的消 减 杂 交技 建 术 。消减 杂交利用 细胞基 因表达 的差 异性 ， 结合 分 并 子杂交技 术去 除共 同序 列 、 留差 异 序 列 ， 而 达 到 保 从