WB常见问题总结

WB常见问题总结

Q1：两快玻璃板之间灌胶,胶为什么总是不平?

1）玻璃没有洗干净。

2）过硫酸铵和TEMED的加量不合适，加量相对较多，凝胶凝固过快也会胶不平，最多按照分子克隆加倍。

3）加完试剂以后没有很好的摇匀，导致有些部位的聚合剂浓度过高，聚合相对较快造成胶不平。

4）稍微注意手法，均匀加入。

5）灌胶后应该用水或者正丁醇压胶面。

6）边缘胶是不容易聚合完全的，灌完胶后要立即加无水正丁醇覆盖，浓度越低的胶越不要使用双蒸水压顶，另外还可以在压顶试剂如正丁醇中添加少许AP来增加边缘胶的凝聚强度。

7）温度也是影响胶聚合的重要因素，可能为了让胶更快的凝固而把胶放到50度的温箱，由于受热不均匀，也会造成胶聚合不均匀。

Q2：胶为什么总是漏？

1）每次电泳完后，洗净玻璃、胶条和其它附件。

2）避免玻璃边缘（与胶条接触处）破损很重要，尤其是下面和胶条接触的地方。

3）关键是找一块很平的桌面，使两块玻璃底面非常齐就行了。

4）胶条一定要干，跑完电泳后，胶条就放在实验台上晾着。

5）下面的胶条注意不要老化，如果有裂纹的话用保鲜膜垫在上面，也可以有效防止漏胶，或者反过来用。

6）玻璃在使用过程中容易造成小的缺口，从而导致封条无法完全密封，装好架子后，在玻璃底边上抹上一层薄薄的凡士林就好了，两边多点（容易从两边漏）这样就不会漏了，就算是用了很久的很多小缺口的玻璃都没有问题，然后转移到电泳槽的时候，去掉封条，把底上的凡士林擦干。（注意，一定要擦干净，尤其是少量进入了两隔玻璃之间空腔的，因为凡士林不导电，会影响电泳的效果。）

7）可以在海绵垫下再垫一些纸，使得它与玻璃贴的更紧密。或者在玻璃底部用琼脂糖封上。

8）因为两块玻板没有放的完全对齐，底部不在同一个平面，所以封条封不严，重新对齐后就不漏了。以后每次只要在水平的桌面上仔细对齐两块玻板，再夹紧。用手感觉一下确定在同一平面上后，放到灌胶架并压在封条上，卡紧。注意两边均匀用力，一般不会再漏。

9）先把两块玻片放在夹子上，不要加紧，放到架子上，使两块玻片的底部对齐，夹紧两块玻片，然后取下再在其下面垫上垫片，这样一般就不会漏胶了。

Q3：条带跑得比正常的窄？

1）可能因为胶凝的不均匀，聚合的不是很好，灌胶的时候尽量混匀.

2）可能与拔梳子有关，拔梳应该迅速，冲洗加样孔的时候要小心，以免把上样带扭曲；

胶配好了用枪吹几下再灌胶，还有就是要等指示剂跑到两层胶交界成一线时，再调高电压。

3）可能是样品的问题，如果盐浓度较高，便会挤压其它条带，致使条带宽窄不一，由于同样的原因，样品在凝胶中的速度会很慢，造成条带走的较慢。

4）常见的原因是：每孔上样量不均匀，应确保每孔中上样量一致。

5）有可能是电极缓冲液，也有可能是凝胶缓冲液，更新缓冲液。

Q4：为什么会有“微笑”和“倒微笑”这样的效果呢？

1）"微笑"是因为灌胶的时候冷却不均匀，中间部分冷却不好，导致凝胶中的分子有不同的迁移率所致。这种情况在较厚的凝胶以及垂直电泳时常常发生。“倒微笑“也称“皱眉”现象常常是由于垂直电泳时电泳槽的装置不合适引起的，特别是当凝胶和玻璃板组成的三明治底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全便会产生这种现象

2）书上说出现“微笑”是因为整个胶冷凝的不均匀，中间部分和两端受热不一样而致成了“倒微笑”可能是因为两端的胶凝的不好，加APS和TEMED后应该混合均匀。

3）样品中盐浓度过高？点样量太多或每孔点样量不均匀？电泳电压不稳定或过高。

Q5：Western-blot制胶时好多泡泡怎么办？

1）首先，玻璃板一定要洗干净，用洗洁净洗，冲干净后再用双蒸水冲一，晾干。配胶的时候沿管壁缓缓加入各个成分，混匀的时候用手轻轻摇匀，如果用枪吹打时要缓慢且不要打到头。

2）配胶时混匀要轻，尽量不产生气泡，上胶时要快，枪也不打到底。加完分离胶后用双蒸水封，待其凝固。即使在上胶时液面上有气泡，加水后也会浮上来。分离胶凝好后，倒掉里面的水，用吸水纸吸干，再加浓缩胶，迅速插梳子。

3）倒胶的时候，用1ml的枪沿一侧缓缓加入，不要打到头，以免带入气泡！

4）将胶在小烧杯里配好后，将电泳槽略微倾斜，将烧杯的嘴靠在玻璃边缘，直接倒进去，速度快，而且不容易产生气泡，不妨试试

5）用双蒸水封时建议用200ul的枪加水，这样压力小，以免把胶冲起来！

6）国产的只能是缓慢加样，别把气泡加进去。如果加进去了，小心把整个板在桌上敲敲可以让气泡浮上来。

7）分离胶中的气泡与插梳子有关，垂直插容易产生气泡，且不容意排除。将梳子倾斜5-10度插入，即使产生气泡也可以也可以通过轻轻晃动梳子使气泡从一侧逸出。

8）还有一个制胶起泡泡的原因，就是配胶的液体全部在四度存放，室温制胶时由于温差及凝胶聚合反应放热的关系，液体中微小的气泡在凝固的凝胶中也会放大成可见的较大的泡泡，这种情况在夏天室温较高时更容易出现。避免的方法是将制胶成分中除催化剂外的部分配置后放室温下静置一会儿，减小温差后再加入催化剂制胶。

Q6：背景过高

1）封闭不全。

2）一抗或者封闭液与膜蛋白的交叉反应。

3）一抗或二抗中某些不纯的物质也可以造成背景。

4）抗体浓度太高，或孵育时间太常都可能遇到这种情况。

5）膜或者缓冲液污染

6）膜没有完全浸润

7）封闭时间的控制

8）洗膜没有洗干净

Q7：杂带多

1）杂蛋白多，目的蛋白经处理后有变化

2）抗体特异性不强

3）降低一二抗孵育时间和浓度

4）增加洗涤次数

5）合理的封闭方法

6）确认二抗与样本抗原有无交叉反应