高速逆流色谱法 PPT
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高速逆流色谱PPT课件
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12
2 溶剂体系选择的步骤
（1）预测要分离物质的极性，粗选一个溶剂体系；
（2）取少量样品于上下相各2毫升的溶剂体系中，用
TLC进行检验，可加入甲醇、乙醇、醋酸乙酯等来调 节
溶剂体系的极性，直到样品在上下相中的分配比K为
0.5~2为止；
（3）用HPLC测定K值；
（4）用分析型HSCCC进行预分离，再用制备型高速
氯仿-甲醇-水 木脂素和香豆素 正己烷-乙睛-醋酸乙酯-水
正己烷-甲醇-水
氯仿-甲. 醇-水
17
四、应用
溶剂系统
两相溶剂系统：正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水（6：3： 2：5），在分液漏斗中充分混合，临用前将其分开。
.
18
分离条件： 室温下，上相为固定相，下相为流动相，流速为 0.7ml/min； 洗脱方式：由首端向尾端洗脱； 主机：正转，流速为800r/min
高速逆流色谱
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1
一、概述 高速逆流色谱（High-Speed Countercurrent Chromatography,HSCCC）是一种连续高效的 液液分配色谱分离技术。该技术不需要固体支撑 体，主要依据物质在两相中分配系数的不同对物 质进行分离，相对其他常用色谱（如柱色谱、高 效液相色谱等）来说，具有无不可逆吸附和回收 率高的特点，特别适合于天然活性成分的分离。
柱温等
.
5
检测器
紫外-可见光检测器
蒸发光散射检测器
质谱检测器等
.
6
/v/b/18605037-1585286663.html /v/b/18615566-1585286663.html
.
7
与其它色谱分离技术相比，高速逆流色谱具有
《高速逆流色谱》课件
高速逆流色谱的原理
基于液液分配原理，通过调整溶剂系统的组成和比例，使目标成分在两相溶剂之间进行 高效分配。
通过连续旋转和轴向扩散，使固定相和流动相在管内形成多层相际界面，从而实现高效 分离。
高速逆流色谱的应用
在天然产物分离纯化中应用广泛，可分离各种类型的化合物，如黄酮类、生物碱类 、皂苷类等。
在合成化学、药物分析、环境监测等领域也有广泛应用，可用于分离手性化合物、 纳米材料、高分子聚合物等。
高速逆流色谱仪的维护与保养
定期清洗分离柱
根据使用情况定期清洗分离柱， 保持其良好的分离效果。
定期校准检测器
根据仪器使用情况定期校准检测 器，确保其准确性。
检查输液泵的密封性
确保输液泵的密封圈完好无损， 防止流动相泄漏。
清洁仪器表面
定期用适当的清洁剂擦拭仪器表 面，保持其清洁。
Part
03
高速逆流色谱分离技术
高速逆流色谱
• 引言 • 高速逆流色谱的设备 • 高速逆流色谱分离技术 • 高速逆流色谱在药物分离中的应用 • 高速逆流色谱在天然产物分离中的应用 • 高速逆流色谱的未来发展与展望
目录
Part
01
引言
高速逆流色谱的定义
01
高速逆流色谱是一种不依赖于任 何形式的固定相的液液分配色谱 技术。
02
它利用高速旋转的螺旋管产生离 心力，使两种不相溶的溶剂在螺 旋管内分离，从而实现高效、连 续的混合物分离。
高速逆流色谱分离技术的原理
高速逆流色谱分离技术是一种不基于 任何固定相的液-液分离技术，利用两 相溶剂之间的相对运动，实现混合物 中各组分的分离。
高速逆流色谱分离技术具有高分离效 率、高分辨率、操作简便等优点，广 泛应用于天然产物、药物、蛋白质等 复杂混合物的分离纯化。
逆流色谱ppt课件
现在，对农用化学品以及排放的手性污染 物也引起人们的高度重视。
22
手性分离和分析的重要性
★ 获取单一对映体化合物 ★ 对于涉及分子手性分析的领域要采用高对映 体选择性的分析方法
手性分离的特殊性
在非手性环境中，对映体的物理化学性质（如熔点、 沸点、折射率、蒸气压、溶解度、红外、核磁谱和质 谱等）大都相同，这就造成对映体分离的困难。
手性添加剂法拆分苯基琥珀酸
O
OH OH O
(±)-PSA可采用光 活性的番木鳖碱或
(-)-脯氨酸拆分
15 mmol/Lβ-CD + 3% CH3CN + 0.05 %CF3COOH
0.30 mmol/L TM-β-CD +16%CH3CN +0.05%CF3COOH
Nova-pak C18色谱柱
31
CH3
+3.82o , mp 25.8oC -3.82 o , mp 25.8oC
右旋乳酸 , d-或(+)-
左旋乳酸 , l-或(-)-
图1 乳酸分子的镜像关系
20
沙利度胺（Thalidomide）
--------天使还是魔鬼？
俗名“反应停”，早期作为 怀孕妇女的止呕药使用
50年代末，在欧洲出现数千例短肢 畸胎新生儿，一度震惊全世界
12
逆流色谱技术的特点
1．逆流色谱不用固态支撑体; 2．两相处于离心力场中，成液滴装、样品在
其表面分配； 3．无死体积，柱子体积大，制备量大； 4．分离过程不是淋洗或洗脱过程，而是对流
穿透过程。
13
基本操作
• 溶剂系统的选择： • 样品溶解：等量的预先平衡的上下相； • 溶剂分离：如线圈为300ml,则实验一次要
22
手性分离和分析的重要性
★ 获取单一对映体化合物 ★ 对于涉及分子手性分析的领域要采用高对映 体选择性的分析方法
手性分离的特殊性
在非手性环境中，对映体的物理化学性质（如熔点、 沸点、折射率、蒸气压、溶解度、红外、核磁谱和质 谱等）大都相同，这就造成对映体分离的困难。
手性添加剂法拆分苯基琥珀酸
O
OH OH O
(±)-PSA可采用光 活性的番木鳖碱或
(-)-脯氨酸拆分
15 mmol/Lβ-CD + 3% CH3CN + 0.05 %CF3COOH
0.30 mmol/L TM-β-CD +16%CH3CN +0.05%CF3COOH
Nova-pak C18色谱柱
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CH3
+3.82o , mp 25.8oC -3.82 o , mp 25.8oC
右旋乳酸 , d-或(+)-
左旋乳酸 , l-或(-)-
图1 乳酸分子的镜像关系
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沙利度胺（Thalidomide）
--------天使还是魔鬼？
俗名“反应停”，早期作为 怀孕妇女的止呕药使用
50年代末，在欧洲出现数千例短肢 畸胎新生儿，一度震惊全世界
12
逆流色谱技术的特点
1．逆流色谱不用固态支撑体; 2．两相处于离心力场中，成液滴装、样品在
其表面分配； 3．无死体积，柱子体积大，制备量大； 4．分离过程不是淋洗或洗脱过程，而是对流
穿透过程。
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基本操作
• 溶剂系统的选择： • 样品溶解：等量的预先平衡的上下相； • 溶剂分离：如线圈为300ml,则实验一次要
高速逆流色谱高速逆流色谱高速逆流色谱高速逆流色谱
高速逆流色谱High Speed Countercurrent Chromatography（HSCCC）逆流色谱是利用溶质在两种互不相溶的溶剂中的分配系数不同，应用色谱层析的方法，将不同溶质分离。
逆流色谱的发展从逆流分配、液滴逆流色谱直至现在的高速逆流色谱，经历了近60年的历程，技术和设备均已日益成熟，现越来越多地应用于中药及天然药物的研究开发。
高速逆流色谱特点：! 无不可逆吸附# 液—液层析系统，无样品与固定相之间的不可逆吸附! 高回收率# 流动相和固定相均为液体，样品可全部回收! 操作简便# 固定相为液体，体系更换、平衡方便、快捷。
高速逆流色谱原理：高速逆流色谱是利用螺旋柱在行星运动时产生的离心力，使互不相溶的两相不断混合，同时保留其中的一相（固定相），利用恒流泵连续输入另一相（流动相），随流动相进入螺旋柱的溶质在两相之间反复分配，按分配系数的次序，被依次洗脱。
在流动相中分配比例大的先被洗脱，反之，在固定相中分配比例大的后被洗脱。
图1是螺旋柱中互不相溶的两相溶剂在行星运动时的流体动力学运动及分配示意图。
上图，在达到稳定的流体动力学平衡态后，柱中呈现两个截然不同的区域：在靠近离心轴心大约有四分之一的区域（混合区）呈现两相的激烈混合。
其余区域（静置区）两溶剂相分成两层：较重的溶剂相在外部，而较轻的溶剂相在内部，两相形成一个线状分界面。
下图，I到IV的展开柱，分别与上图中I到IV位置相对应，每一混合区以跟柱旋转速度相同的速度向柱头端移动（与海面波的运动相似）。
在螺旋柱中任何一部分，两相溶剂都在反复进行混合和静置的分配过程，这一过程频率极高，当柱以800rpm旋转时，频率超过13次/秒，流动相则不断地穿过固定相。
所以高速逆流色谱在一个较宽的流动相流速范围内，仍有相当高的分配效率。
图1 螺旋柱中两溶剂相流体动力学运动及分配高速逆流色谱应用：1. 旋转速度在逆流色谱中，留在柱中固定相的量是影响溶质峰分离度的一个重要因素，一般说来，高保留量会大大改进峰分离度。
高速逆流色谱法ppt课件
溶剂应该进行分层实验，实验结果决定流速和洗 脱方式
样品要溶解于流动相或固定相之中
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10
五、高速逆流色谱的应用
天然药物的分离和分析 氨基酸、激素、嘌呤、抗生素等分离分析 蛋白质、细胞至微生物的分离等
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11
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黄连生物碱的分离
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13
2.《高速逆流色谱分离技术与应用》曹学丽，化学工业 出版社，2009年
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2
二、分离原理
连续液液萃取过程，固定相和流动相均为液体 问题是：如何在流动相流动时使固定相不动？
两种基本模式 ➢ 流体静力学平衡系统
• 洗脱速度太慢，一般需要两天或更长时间。
➢ 流体动力学平衡系统
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3
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4
完整版PPT课件5 Nhomakorabea 三、仪器结构
高速逆流色完整版谱PPT的课件仪器流程
6
完整版PPT课件
7
柱：长的软管(如聚四氟乙烯管)绕制成
载体：无
固定相：液体。用某一种有机／水两相溶剂体系或双水 和溶剂体系的上层或下层作为色谱过程的固定相，用离 心力场来支撑住柱内的液态相。
流动相：若用溶剂体系中的另一层作为流动相，带着混 合样品由泵的压力推入分离管柱，样品就会穿过两个液 相对流的整个管柱空间。
第9章 高速逆流色谱法
High Speed Countercurrent Chromatography HSCCC
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1
一、概述
Ito，70年代提出，80年代提出CCC，一种液液 色谱分离技术
逆流分配→液滴逆流色谱→高速逆流色谱
《逆流色谱技术》课件
广泛应用
在中药、生物医药、食品添加剂 等领域，逆流色谱技术被广泛应 用于天然产物的分离和纯化。
在药物分离中的应用
药物分离
逆流色谱技术在药物分离中具有重要作用，能 够分离和纯化药物中的有效成分。
药物质量控制
该技术可用于药物质量控制，确保药物的有效 性和安全性。
药物研发
逆流色谱技术还可用于药物研发，帮助研究人员发现新的药物候选物。
逆流色谱技术的应用范围
01
逆流色谱技术在生物医药领域应用广泛，可用于分离纯化蛋白 质、酶、核酸等生物大分子。
02
此外，逆流色谱技术在天然产物提取、食品分析、环境监测等
领域也有广泛应用。
由于逆流色谱技术具有分离效率高、样品回收率高、操作简便
03
等优点，因此在科研和工业生产中得到了广泛应用。
02
逆流色谱技术的分类
原理
基于溶质在固定相和流动相之间的水动力学 作用进行分离。
优点
分离效果好，可实现连续分离。
应用
适用于分离和纯化大分子化合物，如DNA、 RNA和蛋白质等。
缺点
操作条件较为严格，有时需要大量有机溶剂 。
03
逆流色谱技术的实验设备
分离柱
分离柱是逆流色谱技术中的核心部件，其作用是提供固定相和流动相的相 对运动，从而实现混合物的分离。
素。
03
泵的性能参数如流量、压力等对分离效果有很大影响，需 要精确控制。
检测器
检测器的作用是检测和记录 分离过程中各组分的浓度变
化。
常用的检测器有紫外可见光 检测器、荧光检测器、电导 检测器等。选择合适的检测 器需要考虑被分离物质的性
质和检测灵敏度。
检测器的性能参数如检测限 、线性范围等对分离效果有 很大影响，需要合理选择和 使用。
高速逆流色谱在天然产物分离提取中的应用PPT课件
Tankertanker Design
a.仪器对保留值的影响（外因） Tankertanker Design
研究表明：螺旋管支持件的自转半径r与公转半 径R之比B值是一个影响两相互不混溶溶剂在旋转 螺旋管内保留的关键因素。用大直径的支持件使 值进一步提高，能导致亲水性溶剂体系的单向性 流体动力学分布反向；反之，用小直径的支持件 使值减小，能使疏水性溶剂体系的单向性流体运 动方向反向，而介于疏水性和亲水性溶剂之间的 中间极性溶剂，其两相分布状况则会受到离心力 条件的影响。
Tankertanker Design
多酚类化合物在天然产物中广泛存在，具有 诸多的生物活性。国人最常饮用的茶叶中，所含 茶多酚( 主要功效成分儿茶素) 就具有抗氧化、抗 溶血、抗口臭、抑制致癌物的形成等众多生物活 性和保健功能。
溶剂系统
正己烷-乙酸乙酯-乙腈-水（2：2:1:0.6:2） 乙酸乙酯-乙醇-水（15:1:15） 乙酸乙酯-水（1:1） 正丁醇-乙酸乙酯-水（2:8:5） 乙酸乙酯-水（1:1） 乙酸乙酯-乙醇-水（4:1:5） 石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（1:1:1.2:0.8） 和石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（1:1:1.4:0.6） 梯度洗脱
Tankertanker Des•2ig0n
Tankertanker Design
Tankertanker Design
原料 甘草 结香 浙贝母中 天麻 车前草 白花败酱草 知母
提纯产物 甘草素和异甘草素 丁香苷等 麦角甾苷和异麦角甾苷 天麻苷 类叶升麻苷和异类叶升麻苷 异荭草苷和异牡荆苷 顺-扁柏树脂酚和单甲基-顺-扁柏 树酯酚
是利用混合物不同组分在固定相和流动相中分配系数 (或吸附系数、渗透性等)的差异，使不同组分在作相 对运动的两相中进行反复分配，实现分离的分析方法。
(精选)《逆流色谱技术》PPT课件
Dr. Yoichiro Ito’ discovery
Y. Ito et al, Nature, 212, 985, 1966. (现象) Y. Ito and R.L. Bowman, Science, 167, 281, 1970. (封闭型) Y. Ito and R.L. Bowman, Science, 173, 420, 1971. (流通型) Y. Ito and R.L. Bowman, Science, 182, 391, 1973. (双水相) Y. Ito, J. Suaudeau and R.L. Bowman, Science, 189, 999, 1975(非同步).
35 : 2 : 2
乙酸乙酯 - 正丙醇 - 水
140 : 8 : 80
乙酸乙酯 - 己烷 - 甲醇 - 水
16 : 8 : 7 : 10
乙酸乙酯 - 乙醇 - 水
2:1:2
乙酸乙酯 - 己烷 - 正丙醇 - 水（pH2） 7 : 0.5 : 0.4 : 4
乙酸乙酯 - 己烷 - 甲醇 - 水
2:1:1:1
7:3:5:5
己烷 - 乙酸乙酯 - 甲醇 - 0.5%氯化钠
6:4:5:5
己烷 - 乙酸乙酯 - 甲醇 - 0.5%氯化钠
7:3:5:5
环己烷 - 乙酸乙酯 - 甲醇 - 水
3:2:2:2
环己烷 - 丙酮 - 乙醇 - 水
7:6:1:3
环己烷 - 乙酸乙酯 - 丙酮 - 水
5:3:4:5
戊烷 - 叔丁基甲基醚 - 甲醇 - 水
10卤代烷系列19乙酸乙酯系列乙酸乙酯环己烷甲醇石油醚甲醇80乙酸乙酯10乙酸乙酯20乙酸乙酯20丁醇系列正丁醇10正丁醇22非水相系列系列己烷甲醇己烷23双水相系列16peg1000125potassiumphosphateph80ph9216peg100083potassiumphosphateph7024逆流色谱的应用领域小分子有机物如黄酮糖甙单宁生物碱维生素等蛋白质核酸等活性大分子海产品中的活性蛋白活性多肽无机成分稀土元素既可作为实验室分离手段又能用于制药行业的工业化分离纯化25highspeedcountercurrentchromatographhsccc高速逆流色谱仪rotationalspeed
Y. Ito et al, Nature, 212, 985, 1966. (现象) Y. Ito and R.L. Bowman, Science, 167, 281, 1970. (封闭型) Y. Ito and R.L. Bowman, Science, 173, 420, 1971. (流通型) Y. Ito and R.L. Bowman, Science, 182, 391, 1973. (双水相) Y. Ito, J. Suaudeau and R.L. Bowman, Science, 189, 999, 1975(非同步).
35 : 2 : 2
乙酸乙酯 - 正丙醇 - 水
140 : 8 : 80
乙酸乙酯 - 己烷 - 甲醇 - 水
16 : 8 : 7 : 10
乙酸乙酯 - 乙醇 - 水
2:1:2
乙酸乙酯 - 己烷 - 正丙醇 - 水（pH2） 7 : 0.5 : 0.4 : 4
乙酸乙酯 - 己烷 - 甲醇 - 水
2:1:1:1
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己烷 - 乙酸乙酯 - 甲醇 - 0.5%氯化钠
6:4:5:5
己烷 - 乙酸乙酯 - 甲醇 - 0.5%氯化钠
7:3:5:5
环己烷 - 乙酸乙酯 - 甲醇 - 水
3:2:2:2
环己烷 - 丙酮 - 乙醇 - 水
7:6:1:3
环己烷 - 乙酸乙酯 - 丙酮 - 水
5:3:4:5
戊烷 - 叔丁基甲基醚 - 甲醇 - 水
10卤代烷系列19乙酸乙酯系列乙酸乙酯环己烷甲醇石油醚甲醇80乙酸乙酯10乙酸乙酯20乙酸乙酯20丁醇系列正丁醇10正丁醇22非水相系列系列己烷甲醇己烷23双水相系列16peg1000125potassiumphosphateph80ph9216peg100083potassiumphosphateph7024逆流色谱的应用领域小分子有机物如黄酮糖甙单宁生物碱维生素等蛋白质核酸等活性大分子海产品中的活性蛋白活性多肽无机成分稀土元素既可作为实验室分离手段又能用于制药行业的工业化分离纯化25highspeedcountercurrentchromatographhsccc高速逆流色谱仪rotationalspeed
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10
四、高速逆流色谱的溶剂选择
溶剂体系的选择原则
不造成样品的分解或变性 足够高的样品溶解度 样品在系统中有合适的分配系数 固定相能实现足够高的保留
溶剂应该进行分层实验，实验结果决定流速和洗 脱方式
样品要溶解于流动相或固定相之中
11
五、高速逆流色谱的应用
天然药物的分离和分析 氨基酸、激素、嘌呤、抗生素等分离分析 蛋白质、细胞至微生物的分离等
2
二、分离原理
连续液液萃取过程，固定相和流动相均为液体 问题是：如何在流动相流动时使固定相不动？
两种基本模式 ➢ 流体静力学平衡系统
• 洗脱速度太慢，一般需要两天或更长时间。
➢ 流体动力学平衡系统
3
4
5
三、仪器结构
Байду номын сангаас
高速逆流色谱的仪器流程
6
7
柱：长的软管(如聚四氟乙烯管)绕制成 载体：无 固定相：液体。用某一种有机／水两相溶剂体系或双水 和溶剂体系的上层或下层作为色谱过程的固定相，用离 心力场来支撑住柱内的液态相。 流动相：若用溶剂体系中的另一层作为流动相，带着混 合样品由泵的压力推入分离管柱，样品就会穿过两个液 相对流的整个管柱空间。 分离：溶剂萃取过程成千上万次地、高效地、自动连续 地予以完成。各个组分也就会按其在两相中的分配系数 分离开来。
8
大家有疑问的，可以询问和交流
可以互相讨论下，但要小声点
9
四、方法特点
1． 固定相、流动相均为液体，完全排除了载体对样品组分的吸 附、玷染、变性、失活等不良影响，能避免不可逆吸附造成的色 谱峰拖尾现象，实现高回收。 2．分离柱容积可大， 没有填料，柱内空间均为有效空间。因此， 样品负载量较大，制备量可从毫克到克量级。 3． 逆流色谱不用填料，分离过程不是淋洗或洗脱过程，而是对 流穿透过程。溶剂用量少，成本低。 4. 逆流色谱的分离效率比不上气相色谱和高效液相色谱等技术， 不宜进行复杂混合物的全分析。 5. 适合用于分离纯化，预处理条件宽松，回收率高，制备量大。
第9章 高速逆流色谱法
High Speed Countercurrent Chromatography HSCCC
一、概述
Ito，70年代提出，80年代提出CCC，一种液液 色谱分离技术
逆流分配→液滴逆流色谱→高速逆流色谱
参考书
1.《逆流色谱技术》张天佑，北京科学技术出版社， 1991年
2.《高速逆流色谱分离技术与应用》曹学丽，化学工 业出版社，2009年
12
13
黄连生物碱的分离
14
四、高速逆流色谱的溶剂选择
溶剂体系的选择原则
不造成样品的分解或变性 足够高的样品溶解度 样品在系统中有合适的分配系数 固定相能实现足够高的保留
溶剂应该进行分层实验，实验结果决定流速和洗 脱方式
样品要溶解于流动相或固定相之中
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五、高速逆流色谱的应用
天然药物的分离和分析 氨基酸、激素、嘌呤、抗生素等分离分析 蛋白质、细胞至微生物的分离等
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二、分离原理
连续液液萃取过程，固定相和流动相均为液体 问题是：如何在流动相流动时使固定相不动？
两种基本模式 ➢ 流体静力学平衡系统
• 洗脱速度太慢，一般需要两天或更长时间。
➢ 流体动力学平衡系统
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三、仪器结构
Байду номын сангаас
高速逆流色谱的仪器流程
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柱：长的软管(如聚四氟乙烯管)绕制成 载体：无 固定相：液体。用某一种有机／水两相溶剂体系或双水 和溶剂体系的上层或下层作为色谱过程的固定相，用离 心力场来支撑住柱内的液态相。 流动相：若用溶剂体系中的另一层作为流动相，带着混 合样品由泵的压力推入分离管柱，样品就会穿过两个液 相对流的整个管柱空间。 分离：溶剂萃取过程成千上万次地、高效地、自动连续 地予以完成。各个组分也就会按其在两相中的分配系数 分离开来。
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大家有疑问的，可以询问和交流
可以互相讨论下，但要小声点
9
四、方法特点
1． 固定相、流动相均为液体，完全排除了载体对样品组分的吸 附、玷染、变性、失活等不良影响，能避免不可逆吸附造成的色 谱峰拖尾现象，实现高回收。 2．分离柱容积可大， 没有填料，柱内空间均为有效空间。因此， 样品负载量较大，制备量可从毫克到克量级。 3． 逆流色谱不用填料，分离过程不是淋洗或洗脱过程，而是对 流穿透过程。溶剂用量少，成本低。 4. 逆流色谱的分离效率比不上气相色谱和高效液相色谱等技术， 不宜进行复杂混合物的全分析。 5. 适合用于分离纯化，预处理条件宽松，回收率高，制备量大。
第9章 高速逆流色谱法
High Speed Countercurrent Chromatography HSCCC
一、概述
Ito，70年代提出，80年代提出CCC，一种液液 色谱分离技术
逆流分配→液滴逆流色谱→高速逆流色谱
参考书
1.《逆流色谱技术》张天佑，北京科学技术出版社， 1991年
2.《高速逆流色谱分离技术与应用》曹学丽，化学工 业出版社，2009年
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黄连生物碱的分离
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