造血干细胞研究进展样本

造血干细胞研究进展
摘要：造血干细胞是具备自我更新、高度增殖和多向分化潜能细胞群体,在人体造血系统中起着至关重要作用。

本文简介了造血干细胞生物学特性、表面标志以血干细胞在干细胞移植、细胞治疗和基因治疗等方面临床应用和前景。

造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)又称多能干细胞,是存在于造血组织中一群原始造血细胞。

也可以说它是一切血细胞原始细胞,即由造血干细胞定向分化、增殖为不同血细胞系,并进一步生成血细胞。

人类造血干细胞一方面浮现于胚龄第2～ 3周卵黄囊,在胚胎初期(第2～ 3月)迁至肝、脾,第5个月又从肝、脾迁至骨髓。

在胚胎末期始终到出生后,骨髓成为造血干细胞重要来源。

造血干细胞是干细胞中研究最早、最多、最进一步一种,近年来在造血干细胞各种研究领域均获得了重要进展。

1 造血干细胞发现
造血干细胞发现源于第二次世界大战后放射医学研究， Jacobson 等[1-3]发现小鼠与豚鼠脾脏与骨髓中存在有一类细胞，即造血干细胞，可以重建经致死剂量射线照射过小鼠与豚鼠造血系统。

随着单克隆抗体技术与流式细胞分选技术浮现，人们运用各种针对细胞表面抗原抗体组合，分离到相对较纯小鼠与人骨髓与胚胎组织中造血干细胞与造血前体细胞群(hematopoietic progenitorcell)。

其中，美国斯坦福大学 Weissman 实验室在分离与鉴定小鼠与人造干细胞方面所做工作最为杰出[4-9]。

长期以来，对于造血干细胞是由各种不同、可以分化成不同种类成熟细胞所构成，还是由一类可以分化成所有造血系统成熟细胞所构成，人们存有争论。

直到 1996 年，Osawa 等[10]通过单个细胞移植办法，验证了一种造血干细胞就可以重建机体整个造血系统，才结束了对于这一问题争论。

2 对小鼠造血干细胞初期发生研究
造血干细胞发生到当前为止，人们对于小鼠造血干细胞初期发生研究得相对较多。

小鼠胚胎在完毕原肠运动(gastrulation)后不久，一群中胚层细胞就被“决定”(determined)将要分化成造血细胞。

小鼠胚胎中各种组织，如卵黄囊(yolk sac)、积极脉 - 性腺 - 中肾(the aorta-gonadmesonephros region ，AGM) 、胎盘以及胚肝，都先后参加了造血细胞发生[16,17](图 1)。

最早造血干细胞在第 7.5 天胚胎外卵黄囊中浮现[18]，这时候造血干细胞重要分化成有核红细胞，这个时期造血称为“原始造血”( p r i m i t i v ehematopoiesis)。

对 BMP-4 基因敲除小鼠研究显示，BMP(bone morphogenetic protein)信号通路参加了原始造血过程[19]。

原始造血只短暂存在于小鼠胚胎第 7 至 11 天，重要功能是为迅速生长胚胎提供氧气供应，随后即迅速消失。

在胚胎第8.5 天，AGM 区域浮现第二波造血干细胞[20,21]，这时候胚胎内部血液循环开始建立，这个阶段造血称为“永久造血”(definitive hematopoiesis)。

永久造血产生造血干细胞可以分化成造血与免疫系统所有终端分化细胞，其造血干细胞功能可以始终延续到成年后来。

在小鼠第 10 天胚胎中，造血干细胞开始向肝脏迁移，到胚胎第 12.5 天时，胚肝成为胚胎最重要造血器官。

在胚胎期第16天时，胚肝造血干细胞开始向骨髓中迁移[6]，这种迁移始终持续到出生后。

最后，骨髓成为成体动物最重要造血器官。

关于发生在卵黄囊“原始造血”与发生在AGM 区域“永久造血”，究竟具备共同还是相对独立来源，当前依然存有争论。

3 造血干细胞生物学特性
造血干细胞是体内各种血细胞唯一来源,存在于骨髓、脐血和外周血中,具备自我更新或自我维持能力、高度增殖潜能、多向分化潜能。

3.1 自我更新或自我维持能力
正常状况下,HSC通过不对称性有丝分裂形成两个子代细胞。

其中一种仍维持造血干细胞所有特性,即自我更新(self- renewal)。

自我更新使得干细胞池大
小(干细胞数量)和质量维持不变,因而又称为自我维持(self- maintenance)。

另一种子细胞在有丝分裂过程中特性发生变化逐渐走向分化途径,成为不同谱系祖细胞、前体细胞和成熟血细胞,代替消耗或者衰老细胞,从而维持循环各种血细胞数量。

3.2 高度增殖潜能
在骨髓中,HSC约占骨髓细胞0.05%,且大多数处在G0期。

正常生理状况下,仅需局限性10%HSC处在增殖状态就足以维持机体恒定造血[1]。

放、化疗导致造血细胞群明显耗竭或在某些细胞因子和HSC动员剂等因素作用下,HSC能大量地分裂,从而有更多HSC进入细胞周期。

3.3 多向分化潜能
HSC不但可分化为各系统血细胞系,如红细胞系、粒细胞系、单核-吞噬细胞系、巨核细胞系以及淋巴细胞系,还具备可塑性,可向某些非造血细胞转化[2],如神经细胞、骨骼肌细胞、肝脏细胞、血管内皮细胞以及各种组织上皮细胞等。

4、造血干细胞生物学特性
造血干细胞(HematopoietieStemCell,HSC)是一小群具备高度自我复制和多向分化潜能最原始造血细胞。

它具备2个重要特性:l)高度自我更新或自我复制能力;2)可分化生成所有类型血细胞。

在发育生物学上,造血干细胞属于成体干细胞一种。

又因其可分化出至少12种血细胞,因此造血干细胞是一种多能干细胞。

正常状况下,造血干细胞通过不对称性有丝分裂形成两个子代细胞。

其中一种仍维持造血干细胞所有特性,即自我更新(sel--fernewal)。

自我更新使得干细胞池大小(干细胞数量)和质量维持不变,因而又称为自我维持(sel--fmiantenance)。

另一种子细胞也许由于基因表达模式发生变化而使得细胞特性浮现变化,从而逐渐走上分化道路。

现已懂得,造血干细胞不是纯一细胞群体,而是由不同年龄级别干细胞构成。

这些不同年龄级别干细胞表面抗原、免疫表型和粘附分子表达不一,
生物学特性也有一定差别。

5 造血干细胞表面标志
HSC存在着不同发育阶段、数量很少、体积较小、比重较轻、形态相似,没有特异形态学特性,至今仍不能单从形态学上来辨认。

因而要对HSC进行研究,一方面必要能把它从造血组织中分离出来。

最惯用办法就是运用HSC表面标志蛋白对其进行分离。

5.1 CD34抗原
CD34分子为105～ 120kD高度糖基化I型跨膜糖蛋白,选取性表达于初期造血干/祖细胞、小血管内皮细胞及胚胎成纤维细胞表面,也许具备细胞间粘附、阻遏造血细胞分化等功能,随着细胞分化成熟逐渐减少甚至消失。

CD34+造血干细胞是一组异质性细胞群体,可进一步分化为CD34+ CD38-和CD34+ CD38+两个亚群。

CD34+细胞群中90%为祖细胞,很少为HSC。

近来研究表白,绝大多数CD34+细胞同步表达CDCP1,分离纯化CDCP1细胞可使NOD/SCID小鼠重建造血,提示CDCP1是一种新造血干细胞表面抗原标志[3]。

近年应用Ly5抗原等位基因不同大鼠品系进行竞争性长期重建(competitive long term recon-sititution,CLTR)分析,发现大鼠体内存在有CD34-HSC群,并可分化为CD34+HSC[4],同步在人、豚鼠和恒河猴骨髓细胞以及人脐血中亦发现具备长期重建造血能力CD34-细胞,并且在长期培养后可形成集落,随着集落形成亦由CD34-转变为CD34+,可见,CD34+造血细胞来源于CD34-。

CD34表面标志从无到有,又从有到无,充分显示了造血干/祖细胞产生、发育、分化和成熟全过程。

5.2 胸腺抗原- 1(Thy- 1,CD90)
Thy- 1抗原作为造血干细胞比CD34分子浮现得早,Thy- 1是细胞表面I型糖蛋白连接分子,表达在初期造血细胞表面,与细胞间粘附关于,介导负增殖信号,抑制细胞增殖分化[5]。

CD34+ Thy- 1+细胞约占CD34+细胞群0.1%～ 0.5%,是具
备高度自我更新能力和多项分化潜能造血干细胞。

因Thy- 1+是造血干细胞表面初期标志,故可运用其为标志进行造血干细胞筛选[6]。

5.3 血管内皮生长因子受体- 2(vascular endo-
thelial growth factor receptor- 2，VEGFR- 2,又称KDR)Ziegler[7]提出KDR是鉴定干细胞标志,并可由此鉴别干细胞和祖细胞。

用RT- PCR证明,在人出生后造血组织中,0.1%～ 0.5%CD34+细胞表达KDR,多能造血干细胞只存在于CD34+KDR+细胞某些,而CD34+ KDR-细胞亚群则重要涉及某些系特异定向祖细胞。

用有限稀释法分析接受异种骨髓移植小鼠CD34+ KDR+细胞中HSC比例成果证明,在骨髓中,HSC比例为20%,经12周长期培养(LTC)分析,骨髓、外周血和脐血中HSC可达25%～ 42%,如在长期培养过程中添加VEGF,HSC比例可增至53%～ 63%。

因而,KDR是一种可用于定义造血干细胞,并使其区别于造血祖细胞阳性功能性标志。

5.4 干细胞因子受体(SCFR,又称c- kit,CD117)
CD117可编码一种穿膜酪氨酸激酶受体分子,应用单克隆抗体证明此分子可存在于造血干细胞膜上,约60%～ 75%CD34+造血干细胞同步表达CD117。

其配体- -干细胞因子(stem cell factor,SCF)在造血干细胞生存和增殖分化中起着重要作用,研究发现CD34+ CD117+比CD34+ CD117-细胞具备更高集落形成能力。

CD117也存在于肥大细胞和急性髓样白血病细胞表面。

5.5 AC133抗原
AC133是更初期造血祖细胞和造血干细胞特异性标记。

它是一相对分子质量为120kD糖蛋白,可与一种新杂交瘤细胞系所产生抗干细胞糖蛋白抗原单克隆IgG抗体特异性结合。

AC133选取性地表达于人胎肝、骨髓和外周血中CD34+造血干/祖细胞表面。

与CD34抗原表达不同是,AC133抗原不表达在人脐静脉血管内皮细胞、KGla细胞(AML细胞系)或纤维母细胞上,同步,AC133+细胞群具有比CD34+细胞群更多初期造血细胞,再植效率更高,并且与白血病和内皮细胞关系密
切[8,9]。

6造血干细胞可塑性(Plastieiyt)
造血干细胞可塑性是指除可以分化为各系血细胞外,还可以分化为各种非造血组织细胞,如神经细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、肝脏细胞、血管内皮细胞以及各种组织上皮细胞等。

当前对造血干细胞多向分化机制仍不清晰,对这一机制探讨以及对造血干细胞定向分化调控将大大扩展其在临床上应用。

由于这不但可以绕过用人胚胎干细胞作为移植治疗细胞来源,并且可以减轻异基因移植带来免疫排斥问题。

7造血干细胞临床应用
造血干细胞正广泛应用于某些疾病治疗,并获得了可观疗效,成为干细胞研究和应用成功范例。

7.1 细胞治疗
细胞治疗,即给患者输注治疗细胞,通过这些细胞在体内发挥功能以达到治病目,如抗肿瘤等。

当前已建立了体外诱导扩增树突状细胞(DC)办法,可以从脐带血或自体外周血干细胞诱导扩增出大量DC,进一步使其装载肿瘤特异性抗原后,诱导抗原特异性CTL杀伤肿瘤细胞。

DC回输疗法已成功地试用于非何杰金淋巴瘤、黑色素瘤、前列腺癌和多发性骨髓瘤等恶性肿瘤晚期患者治疗。

7.2基因治疗
基因治疗是指将外源基因或核酸导入人体防治疾病一种技术和治疗办法。

为了使带有目基因细胞在病人体内长期或永久地表达,必要选一种能在体内自我更新和自我维持永不消灭细胞作为宿主细胞。

造血干细胞因其能自我更新、多向分化,在体内常态造血过程中永不耗竭,同步在分化过程中能保持基因组DNA相对稳定,从而成为某些疾病基因治疗一种抱负靶细胞。

运用造血干细胞作为基因治疗靶细胞其优势在于:(1)取材容易,来源于患者自体或脐带血;(2)自我更新能力强,有助于基因长期、稳定表达;(3)造血干细胞具备向各系分化能力,由其分化而成细胞便可随血液循环分布到身体各处,利于其所揭带外源基因更大限度地发挥治疗作用;(4)造血干细胞无论在骨髓内还是在循环血中,目基因产物都能通过血循环而到达靶器官〔14〕。

近年来,随着造血干细胞采集、分离纯化、体外培养、扩增、以及移植等技术日趋成熟,使造血干细胞在基因治疗中应用得到了技术保证。

但由于造血干细胞仅占骨髓细胞0. 001%,故培养和分离纯化不易。

运用造血干细胞做基因治疗研究,当前面临最大困难是人类造血干细胞基因导入率非常低。

这重要是由于人造血干细胞表面缺少装载治疗基因重组逆转录病毒载体受体,并且,人造血干细胞大某些处在G0静止期,用重组逆转录病毒载体装载治疗基因很难整合到静止期细胞染色体基因组中去。

当前,国内外不少先进实验室正对此进行进一步研究。

一旦这些难题得到理解决,造血干细胞移植治疗适应症可以大大扩展;肿瘤治疗也会浮现一种新纪元。

7.3 造血干细胞移植
造血干细胞移植技术已经逐渐成熟并且得到广泛应用,已经成为治愈恶性血液病和实体瘤等疾病可靠选取,成为干细胞研究和应用成功范例。

大量基本和临床研究表白,经动员外周血中CD细胞数量是骨髓中2倍,因而当前用细胞因子动员外周血干细胞移植已取代了最初采用骨髓来源干细胞移植。

这不但由于从外周血收集细胞比骨髓中收集更容易,痛苦小、无需麻醉,不需留院便能采集到更好细胞,并且外周血于细胞移植具备重建造血功能快、免疫功能恢复早、存活率更高、并发症轻等骨髓干细胞移植所不具备几种明显长处。

造血干细胞移植后骨髓功能全面重建重要涉及2个方面,即骨髓细胞数量和细胞功能恢复及细胞之间互相作用功能完善,后者重要指免疫功能。

外周血干细胞更容易归巢也许是外周血移植
时造血和免疫重建比骨髓移植快因素之一。

脐带血因其免疫抗原性较弱特点,被以为是极具潜力自骨髓来源和外周血来源后,第3种造血干细胞移植来源。

而每份脐血含量仅在lxlO7左右,因而当前普通只用于小朋友。

有了造血干细胞移植支持,临床医生就可以使用超大剂量放疗、化疗,最大限度地清除患者体内癌细胞,然后植人造血干细胞重建被破坏造血和免疫系统。

随着临床和基本研究发展,为其她器官移植奠定基本,又是造血干细胞移植作为支持治疗另一种方面。

异基因造血干细胞移植后,可在受者体内诱导形成供者一受者嵌合体,使受者产生对供者特异、终身耐受。

这样,再进行组织或器官移植,就可以减少免疫排斥发生强度.从而提高移植物存活率。

通报20()6年第41卷第2期此外,通过对自体造血干细胞进行遗传修饰后,使其缺陷基因功能得到补充,也可以用于再生障碍性贫血、p 地中海贫血等骨髓造血功能衰竭和某些先天遗传性疾病或代谢系统疾病移植治疗,并且绕过了免疫排斥问题。

通过基因修饰,还可以赋予干细胞及其子代细胞新特性,如转入多药耐药基因MDR可使其抵抗化疗带来清髓效应;导入某种基因使其可抵抗HW感染等。

7.4 造血干细胞与白血病干细胞
近年来，随着癌症干细胞(cancer stem cell)理论升温，以及在各种肿瘤组织中陆续分离到具备“自我更新”与“定向分化”能力癌症干细胞，使得人们对癌症干细胞来源，以及组织干细胞与癌症干细胞互有关系研究日益进一步。

Dick 实验室通过将 AML 白血病患者不同细胞群移植入免疫缺陷 SCID 小鼠模型，发现 CD34+CD38- 细胞群可以在小鼠中引起 AML 白血病，而 CD34+CD38+与 CD34- 细胞群则无法引起白血病，显示白血病干细胞也许存在于 CD34+ CD38- 细胞群中[108]。

之后，Dick 实验室又证明白血病干细胞来源于正常造血干细胞，而不是造血前体细胞[109]。

然而， Armstrong实验室运用 MLL-AF9 白血病小鼠模型，发现造血前体细胞可以经突变后转变成白血病干细胞[110]。

当前观点以为，
白血病干细胞既可以由正常造血干细胞通过基因突变丧失对其自我更新功能负向调控而产生，也也许由正常造血前体细胞或终端分化细胞通过基因突变重新获得了“自我更新”能力而得来(图 4)。

如果寻找到可以特异性杀伤癌症干细胞药物或治疗手段，将极大地提高癌症治疗效果。

如前所述，癌症干细胞具备许多与正常组织干细胞相似特性，因而人们紧张在使用药物对癌症干细胞进行杀伤同步，也许也会对正常组织干细胞导致伤害。

然而 Morrison 实验室一项研究表白，白血病干细胞与正常造血干细胞对药物会有不同反映，可以实当前不损伤正常造血干细胞前提下，对白血病干细胞实行有效地杀伤[44]。

因而，鉴定不同组织来源癌症干细胞与正常组织干细胞在代谢途径上差别，然后筛选或设计特异性药物杀伤癌症干细胞，将是此后癌症干细胞研究一种重要方向。

8 挑战与展望
尽管造血干细胞已经成功地运用于临床疾病治疗，但是当前造血干细胞研究依然面临着许多挑战。

一方面，与胚胎干细胞以及其她种类组织干细胞(如神经干细胞)不同，造血干细胞当前尚无法实当前体外长期培养。

在体外培养状态下，造血干细胞更倾向于分化而非自我更新。

当前脐带造血干细胞移植很少用于成人白血病治疗，其重要因素就是脐带血中造血干细胞数量太少，无法满足成人治疗所需。

因而，研究细胞内因子与微环境信号对维持造血干细胞自我更新作用机制，对于最后实现造血干细胞在体外长期培养与扩增具备重要意义。

另一方面，近年来 i PS 技术建立与发展解决了长期困扰干细胞治疗领域中免疫排斥问题。

可以一方面运用患者自身皮肤成纤维细胞建立自身 i PS，然后在体外将 i PS 定向分化成所需要细胞，最后植回患者体内，用于疾病治疗。

尽管有报道显示，特定转录因子，如 Hoxb-4 与 Cdx-4 可以使胚胎干细胞向造血
细胞方向分化[113,114]，然而将胚胎干细胞或i PS细胞在体外分化成造血干细胞技术当前依然面临许多难题。

寻找与鉴定在胚胎初期控制造血干细胞发生发育核心因子以及核心信号通路，将有助于最后实当前体外定向诱导胚胎干细胞或 i PS 细胞向造血干细胞有效分化。

第三，研究在各种病理状态( 白血病、贫血、衰老、代谢异常等)或应激状态(如炎症 / 感染、组织损伤等) 下造血干细胞功能变化、造血与免疫系统中终端分化细胞对造血干细胞与前体细胞也许反馈调节作用，以及造血免疫系统外其她组织与器官对造血干细胞功能也许调节作用，也是此后造血干细胞研究领域重要方向。

最后，造血干细胞功能研究强烈依赖于体内实验，因而需要借助转基因和基因敲除 / 敲入等动物模型。

因而，此后对造血干细胞功能进行更加进一步地研究，还将依赖于更多新型动物模型建立，并在此基本上对人造血干细胞进行系统地研究，最后运用于造血系统疾病临床治疗。

HSC具备可塑性,故可用于摸索定向诱导分化条件、调控机理以及用来代替病变或者功能失调器官[18]。

9 结语
近年来,随着造血干细胞有关技术不断发展和完善,越来越多曾被称为“不治之症”顽疾逐渐被攻克,尽管该领域还存在着大量问题,如移植适应证拟定、移植对受者长期生存质量影响、造血生长因子动员干细胞后对供者远近期影响、干细胞体外扩增回输体内后安全问题等[21],但随着研究进一步进一步,必将全面揭示造血干细胞巨大潜力和辽阔临床应用前景。