造血干细胞研究进展

造血干细胞研究进展

摘要：造血干细胞是具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体,在人体造血系统中起着至关重要的作用。本文介绍了造血干细胞的生物学特征、表面标志以血干细胞在干细胞移植、细胞治疗和基因治疗等方面的临床应用和前景。

造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)又称多能干细胞,是存在于造血组织中的一群原始造血细胞。也可以说它是一切血细胞的原始细胞,即由造血干细胞定向分化、增殖为不同的血细胞系,并进一步生成血细胞。人类造血干细胞首先出现于胚龄第2～ 3周的卵黄囊,在胚胎早期(第2～ 3月)迁至肝、脾,第5个月又从肝、脾迁至骨髓。在胚胎末期一直到出生后,骨髓成为造血干细胞的主要来源。造血干细胞是干细胞中研究最早、最多、最深入的一种,近年来在造血干细胞的多个研究领域均取得了重要进展。

1 造血干细胞的发现

造血干细胞的发现源于第二次世界大战后放射医学的研究， Jacobson 等[1-3]发现小鼠与豚鼠的脾脏与骨髓中存在有一类细胞，即造血干细胞，能够重建经致死剂量射线照射过的小鼠与豚鼠的造血系统。随着单克隆抗体技术与流式细胞分选技术的出现，人们利用多种针对细胞表面抗原的抗体组合，分离到相对较纯的小鼠与人骨髓与胚胎组织中的造血干细胞与造血前体细胞群(hematopoietic progenitorcell)。其中，美国斯坦福大学 Weissman 实验室在分离与鉴定小鼠与人的造干细胞方面所做的工作最为杰出[4-9]。长期以来，对于造血干细胞是由多种不同的、可以分化成不同种类成熟细胞所组成，还是由一类可以分化成所有造血系统成熟细胞所组成，人们存有争论。直到 1996 年，Osawa 等[10]通过单个细胞移植的方法，验证了一个造血干细胞就可以重建机体整个的造血系统，才结束了对于这一问题的争论。

2 对小鼠造血干细胞的早期发生的研究

造血干细胞的发生到目前为止，人们对于小鼠造血干细胞的早期发生研究得相对较多。小鼠胚胎在完成原肠运动(gastrulation)后不久，一群中胚层的细胞

就被“决定”(determined)将要分化成造血细胞。小鼠胚胎中的多个组织，如卵黄囊(yolk sac)、主动脉 - 性腺 - 中肾(the aorta-gonadmesonephros region ，AGM) 、胎盘以及胚肝，都先后参与了造血细胞的发生[16,17](图 1)。最早的造血干细胞在第 7.5 天胚胎外的卵黄囊中出现[18]，这时候的造血干细胞主要分化成有核的红细胞，这个时期的造血称为“原始造血”( p r i m i t i v ehematopoiesis)。对BMP-4 基因敲除小鼠的研究显示，BMP(bone morphogenetic protein)信号通路参与了原始造血的过程[19]。原始造血只短暂存在于小鼠胚胎的第 7 至 11 天，主要的功能是为快速生长的胚胎提供氧气供应，随后即迅速消失。在胚胎的第8.5 天，AGM 区域出现第二波造血干细胞[20,21]，这时候胚胎内部的血液循环开始建立，这个阶段的造血称为“永久造血”(definitive hematopoiesis)。永久造血产生的造血干细胞可以分化成造血与免疫系统的所有终端分化细胞，其造血干细胞的功能可以一直延续到成年以后。在小鼠第 10 天的胚胎中，造血干细胞开始向肝脏迁移，到胚胎第 12.5 天时，胚肝成为胚胎最主要的造血器官。在胚胎期的第16天时，胚肝的造血干细胞开始向骨髓中迁移[6]，这种迁移一直持续到出生后。最终，骨髓成为成体动物最主要的造血器官。关于发生在卵黄囊的“原始造血”与发生在AGM 区域的“永久造血”，究竟具有共同的还是相对独立的起源，目前依然存有争论。

3 造血干细胞的生物学特征

造血干细胞是体内各种血细胞的唯一来源,存在于骨髓、脐血和外周血中,具有自我更新或自我维持能力、高度增殖潜能、多向分化潜能。

3.1 自我更新或自我维持能力

正常情况下,HSC经过不对称性有丝分裂形成两个子代细胞。其中一个仍维持造血干细胞的全部特征,即自我更新(self- renewal)。自我更新使得干细胞池的大小(干细胞数量)和质量维持不变,因而又称为自我维持(self- maintenance)。另一个子细胞在有丝分裂过程中特征发生改变逐渐走向分化的途径,成为不同谱系的祖细胞、前体细胞和成熟的血细胞,替代消耗或者衰老的细胞,从而维持循环的各种血细胞的数量。

3.2 高度增殖潜能

在骨髓中,HSC约占骨髓细胞的0.05%,且大多数处于G0期。正常生理情况下,仅需不足10%的HSC处于增殖状态就足以维持机体恒定造血[1]。放、化疗造成造血细胞群明显耗竭或在某些细胞因子和HSC动员剂等因素作用下,HSC能大量地分裂,从而有更多的HSC进入细胞周期。

3.3 多向分化潜能

HSC不仅可分化为各系统的血细胞系,如红细胞系、粒细胞系、单核-吞噬细胞系、巨核细胞系以及淋巴细胞系,还具有可塑性,可向某些非造血细胞转化[2],如神经细胞、骨骼肌细胞、肝脏细胞、血管内皮细胞以及多种组织的上皮细胞等。

4、造血干细胞的生物学特征

造血干细胞(HematopoietieStemCell,HSC)是一小群具有高度的自我复制和多向分化潜能的最原始的造血细胞。它具有2个重要的特征:l)高度的自我更新或自我复制能力;2)可分化生成所有类型的血细胞。在发育生物学上,造血干细胞属于成体干细胞的一种。又因其可分化出至少12种血细胞,所以造血干细胞是一种多能的干细胞。正常情况下,造血干细胞经过不对称性有丝分裂形成两个子代细胞。其中一个仍维持造血干细胞的全部特征,即自我更新(sel--fernewal)。自我更新使得干细胞池的大小(干细胞数量)和质量维持不变,因而又称为自我维持(sel--fmiantenance)。另一个子细胞可能由于基因表达模式发生改变而使得细胞特征出现变化,从而逐步走上分化的道路。现已知道,造血干细胞不是纯一的细胞群体,而是由不同年龄等级的干细胞组成。这些不同年龄等级的干细胞的表面抗原、免疫表型和粘附分子的表达不一,生物学特性也有一定的差异。

5 造血干细胞的表面标志

HSC存在着不同发育阶段、数量极少、体积较小、比重较轻、形态相似,没有特异的形态学特征,至今仍不能单从形态学上来识别。因此要对HSC进行研究,首先必须能把它从造血组织中分离出来。最常用的方法就是利用HSC表面的标志蛋白对其进行分离。

5.1 CD34抗原

CD34分子为105～ 120kD的高度糖基化的I型跨膜糖蛋白,选择性表达于早

期造血干/祖细胞、小血管内皮细胞及胚胎成纤维细胞表面,可能具有细胞间粘附、阻遏造血细胞分化等功能,随着细胞分化成熟逐渐减少甚至消失。CD34+造血干细胞是一组异质性细胞群体,可进一步分化为CD34+ CD38-和CD34+ CD38+两个亚群。CD34+细胞群中90%为祖细胞,极少为HSC。最近研究表明,绝大多数CD34+细胞同时表达CDCP1,分离纯化的CDCP1细胞可使NOD/SCID小鼠重建造血,提示CDCP1是一种新的造血干细胞表面抗原标志[3]。近年应用Ly5抗原等位基因不同的大鼠品系进行竞争性长期重建(competitive long term recon-sititution,CLTR)分析,发现大鼠体内存在有CD34-的HSC群,并可分化为CD34+的HSC[4],同时在人、豚鼠和恒河猴骨髓细胞以及人脐血中亦发现具有长期重建造血能力的CD34-细胞,并且在长期培养后可形成集落,伴随集落的形成亦由CD34-转变为CD34+,可见,CD34+造血细胞起源于CD34-。CD34表面标志从无到有,又从有到无,充分显示了造血干/祖细胞产生、发育、分化和成熟的全过程。

5.2 胸腺抗原- 1(Thy- 1,CD90)

Thy- 1抗原作为造血干细胞比CD34分子出现得早,Thy- 1是细胞表面I型糖蛋白连接分子,表达在早期造血细胞表面,与细胞间粘附有关,介导负增殖信号,抑制细胞的增殖分化[5]。CD34+ Thy- 1+细胞约占CD34+细胞群的0.1%～ 0.5%,是具有高度自我更新能力和多项分化潜能的造血干细胞。因Thy- 1+是造血干细胞表面的早期标志,故可利用其为标志进行造血干细胞的筛选[6]。

5.3 血管内皮生长因子受体- 2(vascular endo-

thelial growth factor receptor- 2, VEGFR- 2,又称KDR)Ziegler[7]提出KDR是鉴定干细胞的标志,并可由此鉴别干细胞和祖细胞。用RT- PCR证实,在人出生后的造血组织中,0.1%～ 0.5%的CD34+细胞表达KDR,多能造血干细胞只存在于CD34+KDR+细胞部分,而CD34+ KDR-细胞亚群则主要包括一些系特异的定向祖细胞。用有限稀释法分析接受异种骨髓移植小鼠CD34+ KDR+细胞中的HSC 的比例结果证实,在骨髓中,HSC的比例为20%,经12周长期培养(LTC)分析,骨髓、外周血和脐血中HSC可达25%～ 42%,如在长期培养过程中添加VEGF,HSC的比例可增至53%～ 63%。因此,KDR是一个可用于定义造血干细胞,并使其区别于造血祖细胞的阳性功能性标志。

5.4 干细胞因子受体(SCFR,又称c- kit,CD117)

CD117可编码一种穿膜酪氨酸激酶受体分子,应用单克隆抗体证明此分子可存在于造血干细胞膜上,约60%～ 75%的CD34+造血干细胞同时表达CD117。其配体- -干细胞因子(stem cell factor,SCF)在造血干细胞的生存和增殖分化中起着重要作用,研究发现CD34+ CD117+比CD34+ CD117-细胞具有更高的集落形成能力。CD117也存在于肥大细胞和急性髓样白血病细胞表面。

5.5 AC133抗原

AC133是更早期造血祖细胞和造血干细胞的特异性标记。它是一相对分子质量为120kD的糖蛋白,可与一种新的杂交瘤细胞系所产生的抗干细胞糖蛋白抗原的单克隆IgG抗体特异性结合。AC133选择性地表达于人胎肝、骨髓和外周血中的CD34+造血干/祖细胞表面。与CD34抗原表达不同的是,AC133抗原不表达在人脐静脉血管内皮细胞、KGla细胞(AML细胞系)或纤维母细胞上,同时,AC133+细胞群含有比CD34+细胞群更多的早期造血细胞,再植效率更高,而且与白血病和内皮细胞关系密切[8,9]。

6造血干细胞的可塑性(Plastieiyt)

造血干细胞的可塑性是指除可以分化为各系血细胞外,还可以分化为多种非造血组织的细胞,如神经细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、肝脏细胞、血管内皮细胞以及多种组织的上皮细胞等。目前对造血干细胞多向分化的机制仍不清楚,对这一机制的探讨以及对造血干细胞定向分化的调控将大大扩展其在临床上的应用。因为这不仅可以绕过用人的胚胎干细胞作为移植治疗的细胞来源,而且可以减轻异基因移植带来的免疫排斥问题。

7造血干细胞的临床应用

造血干细胞正广泛应用于一些疾病的治疗,并取得了可观的疗效,成为干细胞研究和应用的成功范例。

7.1 细胞治疗

细胞治疗,即给患者输注治疗细胞,通过这些细胞在体内发挥功能以达到治病的目的,如抗肿瘤等。目前已建立了体外诱导扩增树突状细胞(DC)的方法,可以从脐带血或自体的外周血干细胞诱导扩增出大量的DC,进一步使其装载肿瘤特

异性抗原后,诱导抗原特异性CTL杀伤肿瘤细胞。DC回输疗法已成功地试用于非何杰金淋巴瘤、黑色素瘤、前列腺癌和多发性骨髓瘤等恶性肿瘤晚期患者的治疗。

7.2基因治疗

基因治疗是指将外源基因或核酸导入人体防治疾病的一种技术和治疗方法。为了使带有目的基因的细胞在病人体内长期或永久地表达,必须选一种能在体内自我更新和自我维持的永不消亡的细胞作为宿主细胞。造血干细胞因其能自我更新、多向分化,在体内常态造血过程中永不耗竭,同时在分化过程中能保持基因组DNA的相对稳定,从而成为某些疾病基因治疗的一种理想靶细胞。

利用造血干细胞作为基因治疗的靶细胞其优势在于:(1)取材容易,来源于患者自体或脐带血;(2)自我更新能力强,有利于基因长期、稳定的表达;(3)造血干细胞具有向各系分化的能力,由其分化而成的细胞便可随血液循环分布到身体各处,利于其所揭带的外源基因更大限度地发挥治疗作用;(4)造血干细胞无论在骨髓内还是在循环血中,目的基因产物都能通过血循环而到达靶器官〔14〕。

近年来,随着造血干细胞采集、分离纯化、体外培养、扩增、以及移植等技术日趋成熟,使造血干细胞在基因治疗中的应用得到了技术保证。但由于造血干细胞仅占骨髓细胞的0. 001%,故培养和分离纯化不易。

运用造血干细胞做基因治疗的研究,目前面临的最大困难是人类造血干细胞的基因导入率非常低。这主要是因为人的造血干细胞表面缺乏装载治疗基因的重组逆转录病毒载体的受体,而且,人的造血干细胞大部分处于G0静止期,用重组逆转录病毒载体装载的治疗基因很难整合到静止期的细胞染色体基因组中去。现在,国内外不少先进的实验室正对此进行深入研究。一旦这些难题得到了解决,造血干细胞移植治疗的适应症可以大大扩展;肿瘤的治疗也会出现一个新的纪元。

7.3 造血干细胞移植

造血干细胞移植技术已经逐渐成熟并且得到广泛的应用,已经成为治愈恶性血液病和实体瘤等疾病的可靠选择,成为干细胞研究和应用的成功范例。大量基础和临床研究表明,经动员的外周血中CD细胞数量是骨髓中的2倍,因此目前用的细胞因子动员的外周血干细胞移植已取代了最初采用的骨髓来源干细胞的移

植。这不仅因为从外周血收集细胞比骨髓中收集更容易,痛苦小、无需麻醉,不需留院便能采集到更好的细胞,而且外周血于细胞移植具有重建造血功能快、免疫功能恢复早、存活率更高、并发症轻等骨髓干细胞移植所不具备的几个显著优点。造血干细胞移植后骨髓功能的全面重建主要包括2个方面,即骨髓细胞数量和细胞功能的恢复及细胞之间相互作用功能的完善,后者主要指免疫功能。外周血干细胞更容易归巢可能是外周血移植时造血和免疫重建比骨髓移植快的原因之一。脐带血因其免疫抗原性较弱的特点,被认为是极具潜力的自骨髓来源和外周血来源后,第3种造血干细胞移植的来源。而每份脐血的含量仅在lxlO7左右,因此目前一般只用于儿童。有了造血干细胞移植的支持,临床医生就可以使用超大剂量的放疗、化疗,最大限度地清除患者体内的癌细胞,然后植人造血干细胞重建被破坏的造血和免疫系统。随着临床和基础研究的发展,为其他器官的移植奠定基础,又是造血干细胞移植作为支持治疗的另一个方面。异基因造血干细胞移植后,可在受者体内诱导形成供者一受者嵌合体,使受者产生对供者特异的、终生的耐受。这样,再进行组织或器官移植,就可以降低免疫排斥发生的强度.从而提高移植物的存活率。通报20()6年第41卷第2期此外,通过对自体造血干细胞进行遗传修饰后,使其缺陷基因的功能得到补充,也可以用于再生障碍性贫血、p地中海贫血等骨髓造血功能衰竭和某些先天遗传性疾病或代谢系统疾病的移植治疗,而且绕过了免疫排斥的问题。通过基因修饰,还可以赋予干细胞及其子代细胞新的特性,如转入多药耐药基因MDR可使其抵抗化疗带来的清髓效应;导入某种基因使其可抵抗HW的感染等。

7.4 造血干细胞与白血病干细胞

近年来，随着癌症干细胞(cancer stem cell)理论的升温，以及在多种肿瘤组织中陆续分离到具有“自我更新”与“定向分化”能力的癌症干细胞，使得人们对癌症干细胞的起源，以及组织干细胞与癌症干细胞相互关系的研究日益深入。Dick 实验室通过将 AML 白血病患者的不同的细胞群移植入免疫缺陷的SCID 小鼠模型，发现 CD34+CD38- 细胞群能够在小鼠中引发 AML 白血病，而CD34+CD38+与 CD34- 细胞群则无法引发白血病，显示白血病干细胞可能存在于CD34+ CD38- 细胞群中[108]。之后，Dick 实验室又证明白血病干细胞起源于正

常的造血干细胞，而不是造血前体细胞[109]。然而， Armstrong实验室利用MLL-AF9 白血病小鼠模型，发现造血前体细胞可以经突变后转变成白血病干细胞[110]。目前的观点认为，白血病干细胞既可以由正常的造血干细胞经过基因突变丧失对其自我更新功能的负向调控而产生，也可能由正常的造血前体细胞或终端分化细胞经过基因突变重新获得了“自我更新”能力而得来(图 4)。

如果寻找到能够特异性杀伤癌症干细胞的药物或治疗手段，将极大地提高癌症治疗的效果。如前所述，癌症干细胞具备许多与正常组织干细胞相似的特性，因此人们担心在使用药物对癌症干细胞进行杀伤的同时，可能也会对正常的组织干细胞造成伤害。然而 Morrison 实验室的一项研究表明，白血病干细胞与正常的造血干细胞对药物会有不同的反应，能够实现在不损伤正常造血干细胞的前提下，对白血病干细胞实施有效地杀伤[44]。因此，鉴定不同组织来源的癌症干细胞与正常组织干细胞在代谢途径上差异，然后筛选或设计特异性药物杀伤癌症干细胞，将是今后癌症干细胞研究的一个重要方向。

8 挑战与展望

尽管造血干细胞已经成功地运用于临床疾病的治疗，但是目前造血干细胞的研究依然面临着许多挑战。

首先，与胚胎干细胞以及其他种类的组织干细胞(如神经干细胞)不同，造血干细胞目前尚无法实现在体外的长期培养。在体外培养状态下，造血干细胞更倾向于分化而非自我更新。目前脐带造血干细胞移植很少用于成人白血病的治疗，其主要原因就是脐带血中的造血干细胞数量太少，无法满足成人治疗所需。因此，研究细胞内因子与微环境信号对维持造血干细胞自我更新的作用机制，对于最终实现造血干细胞在体外的长期培养与扩增具有重要意义。

其次，近年来 i PS 技术的建立与发展解决了长期困扰干细胞治疗领域中的免疫排斥问题。可以首先利用患者自身皮肤的成纤维细胞建立自身的 i PS，然后在体外将 i PS 定向分化成所需要的细胞，最后植回患者体内，用于疾病的治疗。尽管有报道显示，特定的转录因子，如 Hoxb-4 与 Cdx-4 可以使胚胎干细胞向造血细胞方向分化[113,114]，然而将胚胎干细胞或i PS细胞在体外分化成造血干细胞的技术目前依然面临许多难题。寻找与鉴定在胚胎早期控制造血干细

胞发生发育的关键因子以及关键的信号通路，将有助于最终实现在体外定向诱导胚胎干细胞或 i PS 细胞向造血干细胞的有效分化。

第三，研究在各种病理状态( 白血病、贫血、衰老、代谢异常等)或应激状态(如炎症 / 感染、组织损伤等) 下造血干细胞功能的变化、造血与免疫系统中终端分化细胞对造血干细胞与前体细胞的可能的反馈调节作用，以及造血免疫系统外的其他组织与器官对造血干细胞功能可能的调节作用，也是今后造血干细胞研究领域的重要方向。最后，造血干细胞的功能研究强烈依赖于体内实验，因而需要借助转基因和基因敲除 / 敲入等动物模型。因此，今后对造血干细胞功能进行更加深入地研究，还将依赖于更多新型动物模型的建立，并在此基础上对人造血干细胞进行系统地研究，最终运用于造血系统疾病的临床治疗。HSC具有可塑性,故可用于探索定向诱导分化的条件、调控机理以及用来代替病变或者功能失调的器官[18]。

9 结语

近年来,随着造血干细胞相关技术的不断发展和完善,越来越多的曾被称为“不治之症”的顽疾逐渐被攻克,尽管该领域还存在着大量问题,如移植适应证的确定、移植对受者长期生存质量的影响、造血生长因子动员干细胞后对供者的远近期影响、干细胞体外扩增回输体内后的安全问题等[21],但随着研究的进一步深入,必将全面揭示造血干细胞的巨大潜力和广阔的临床应用前景。