蛋白质组学Proteomics课件

当不同状态的细胞被裂解后，分别加入不同标记的 ICAT与总蛋白质反应。ICAT的反应基团会专一与蛋 白质中的Cys共价结合，待充分反应后，将二者等量 混合，再用胰蛋白酶酶解，HPLC分离，就可对含生 物素ICAT酶解片段进行串联质谱分析。
• 当不同状态的细胞被裂解后，分别加入不 同标记的ICAT与总蛋白质反应。ICAT的反 应基团会专一与蛋白质中的Cys共价结合，
• Maldi使得对生物大分子的电离成为了可能。这是因为 Maldi可以使不具挥发性的生物样品汽化、电离，直接进 入气态。要分析的样品和基质——通常是丙三醇和钴粉混 合在一起。这种基质可以吸收来自氮气激光的337nm 波 长的紫外激光并将其转化为热能，同时一小部分基质包括 最上表面的分析物被迅速加热，从样品中气化。由于基质 吸收了大多数的瞬时激光的能量，分子量高达1000000道 尔顿的分子也能被成功地分解。
ICAT的优点
• ICAT具有广泛的兼容性，主要表现在：(1) 能够兼容分析任何条件下体液、细胞、组 织中绝大部分蛋白质；(2)烷化反应即使在 盐、去垢剂、稳定剂(如SDS、尿素、盐酸 胍等)存在下都可进行；(3)只需分析含Cys 残基的肽段，从而降低了蛋白质混合物分 析的复杂性；(4)ICAT战略允许任何类型的 生化、免疫、物理的分离方法，因此能很 好地定量分析微量蛋白质。
待充分反应后，将二者等量混合，再用胰 蛋白酶酶解，HPLC分离，就可对含生物素 ICAT酶解片段进行串联质谱分析。一对 ICAT标记来源不同细胞状态下的相同肽段
总是一前一后相邻分布在质谱图上，且分 子量正好相差8。通过MS／MS鉴定出该片
段属于何种蛋白质后，计算二者峰值的差
异，就可知这种蛋白质在二种细胞状态下 表达的情况。
Madil 和Tof质量分析器的联用
• Maldi大多数情况下是和Tof（飞行时间）质量分析器联用 的。在Maldi－Tof装置中，离子的形成、分离和检测都是 在高真空环境中完成的。当从离子源加速之后，由于势能 的差别，就在飞行管中以不同的速度进行飞行。离子的质 量越小，就以越快的速度穿过飞行管到达检测器。因此， 各不相同的离子质量，也就对应了不同的飞行时间，这就 是离子分离的原理。Maldi－Tof质谱分析既可以用于生物 大分子的质量分析，例如低聚核苷酸、低聚糖、糖蛋白等； 又可以用来生成附加的信息，例如从胰蛋白酶消化液中识 别蛋白质、监测生物分子反应的动力学、表征蛋白质的结 合和阐明蛋白质更高级的结构等。
ESI-MS的特点
• 可以和液相色谱、毛细管电泳等现代化的 分离手段联用，从而大大扩展了其在生命 科学领域的应用范围，包括药物代谢、临 床和法医学的应用等 。
• 相对于MALDI，对于蛋 白的检测灵敏度更 高，常可达到飞克级水平以下。
串联质谱
• 通常, 样本蛋白质先由胰蛋白酶酶解成肽 段, 形成多肽混合物。 此混合物送入多维 高压液相色谱仪及串联质谱仪, 在一级质 谱中进行肽段离子化, 被选离子(母离子)经 碰撞诱导解离(collision induced dissociation, CID) 在二级质谱中产生串 联质谱。
基于整体蛋白的质谱差异分析
• 表面增强激光解析电离飞行时间质谱( surface-enhanced laser • desorptionPionization time of flightmass spectrometry , SELDI • TOF/MS)法由Ciphergen公司推出,将蛋白质芯片技术与质谱联用, • 通过质谱峰度直接反映样品中的蛋白差异。可使用不同化学表面(疏 • 水、亲水、阳离子、阴离子、金属离子螯合)和生物表面(抗原-抗体、 • 受体-配体、DNA-蛋白质)的芯片,与样品混合,与芯片表面结合的整 • 体蛋白被TOF/MS解离出来,从一级质谱图上可得到蛋白的分子量及 • 相对强度,通过对多份样品的平行试验和软件分析,找出不同组间有 • 显著性差异的蛋白(以分子量值表示)。
应用实例
•Baidu Nhomakorabea1.通过比较给药前后细胞的蛋白质组, 鉴别出毒理学的蛋白质标志物 。
• 2. 疟疾疫苗的研究。
ICAT技术
同位素标记的亲和标签（isotope-coded affinity tag， ICAT）技术作为一种体外标记稳定同位素的相对定量方法， 已经成为重要的蛋白质组学定量分析方案。1999年，Gygi 等人用化学方法合成一种能和半胱氨酸反应的亲和试剂， 称为稳定同位素编码的亲和标签，它有轻链和重链(稳定重 同位素)两种形式，可以在体外标记不同状态下的蛋白质样 品，酶解并用亲和柱分离纯化被标记的肽段后，再用质谱 进行分析，和体内标记法一样也能够得到成对的峰表示不 同样品中肽段及对应蛋白质含量的差异。这种稳定同位素 亲和标签技术可以广泛地应用在细胞和组织的定量蛋白质 组学分析上，提供精确的蛋白质相对定量数据。
双向凝胶电泳
• 首先利用等电点聚焦来分离不同等电点的 蛋白，再利用SDS－PAGE来分离不同分子 量的蛋白，其分辨率是非常高的。微克级 的蛋白质就可以被很好的分辨开了。
基质辅助的激光解吸电离技术
（MALDI）的发展
• 日本岛津公司的田中耕一的工作，是质谱分析发 展的一个主动力。 1987年，在第二届中－日质谱 分析联合讨论会上，田中耕一论述了软激光解吸 附技术可以使蛋白质分子离子化。一年之后，他 的这篇创造性的论文发表在Rapid Communications in Mass Spectrometry上。田中 耕一的工作为基质辅助的激光解吸电离技术 （Maldi）打下了基础。2002年，他和弗吉尼亚联 邦大学的John B Fenn，由于他们对软吸附电离 方法上的贡献一起被授予了该年度诺贝尔化学奖
• 在Maldi发明之前，蛋白质分子由于其较高的分子量实际 上被排除在质谱分析之外，而且使用传统的技术也难以对 蛋白质进行研究。
• 早期的激光解吸附质谱分析，将研究局限在相对分子量大 约为5000～10000的范围内，这个限制就排除了对大多数 蛋白质的研究，因为大多数的蛋白质分子在电离过程中容 易散射而分解掉。