双荧光素酶报告实验
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【双荧光素酶报告实验】
专业
目录
01 02 03
实验原理 实验步骤 参考案例
1
目录
01 02 03
实验原理 实验步骤 参考案例
2
01
实验原理
1
实验简介
2
实验原理
3
实验结果图
3
01
实验原理
1
实验简介
· 介绍：是通过将预测能够与miRNA结合的靶基因3’UTR序列插入载体中萤火虫荧光蛋 白（firefly luciferase）的3’UTR。
Step3：检测荧光素酶活性 至肝癌细胞Huh7中，转染24 h后裂解细胞，12000 rpm离心1 min，收集上清。使用双荧光素酶报告基
因检测系统 (Dual-Luciferase® Reporter Assay System，E1910，Promega) 检测荧光素酶活性。每个
细胞样品中加入100 μL萤火虫荧光素酶工作液检测萤火虫荧光素酶 (Firely lueiferase)，加入100 μL海肾
报告基因检测系统 (Dual-Luciferase® Reporter Assay System，E1910，Promega) 检测荧光素酶活性
。每个细胞样品中加入100 μL萤火虫荧光素酶工作液检测萤火虫荧光素酶 (Firely lueiferase)，加入100
Step2：共转染 μL海肾荧光素酶工作液检测海肾荧光素酶 (Renilla lueiferase)，以萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶作为
反应
双荧光素酶反应体 积：20ul（细胞裂 解产物）-100ul（ 萤火虫荧光素酶底 物）-100ul（海肾 荧光素酶底物）， 底物量可根据实际 情况调整，但一定 要保证底物过量， 不然会造成检测结 果出现大的偏差。
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目录
01 02 03
实验原理 实验步骤 参考案例
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03
参考案例
1
案例一
2
案例二
报告基因检测系统 (Dual-Luciferase® Reporter Assay System，E1910，Promega) 检测荧光素酶活性 。每个细胞样品中加入100 μL萤火虫荧光素酶工作液检测萤火虫荧光素酶 (Firely lueiferase)，加入100 μL海肾荧光素酶工作液检测海肾荧光素酶 (Renilla lueiferase)，以萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶作为 相对荧光素酶活性。实验重复3次。
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03
参考案例
1
案例一
分别构建靶基因CADM1双荧光素酶报告基因载体以及与miR-XX结合位点突变的突变体：PGLOCADM1 WT和PGLO-CADM1 MUT。将两种报告质粒与过表达质粒miR-XX mimic和阴性对照质粒分别
Step1：构建载体 共转染至肝癌细胞Huh7中，转染24 h后裂解细胞，12000 rpm离心1 min，收集上清。使用双荧光素酶
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03
参考案例
2
案例二
生物信息学进行LINC01082和miR-XX结合关系的分析，利用荧光素酶报告法验证miR-XX是 LINC01082的直接靶点，人工合成LINC01082 基因片段利用内切酶位点SpeI 和Hind III 引入pMIRreporter (北京华越洋生物科技有限公司) 中，在LINC01082野生型上设计种子序列的互补序列突变位点 ，通过限制性内切酶酶切后使用T4 DNA 连接酶将目的片段插入到pMIR-reporter 报告质粒中。将测序 正确的荧光素酶报告质粒WT和MUT分别与miR-XX共转染至细胞HEK-293T (上海北诺生物科技有限公司) 中。转染48 h后收集并裂解细胞，使用荧光素酶检测试剂盒 (K801-200，Biovision 公司) Glomax20/20
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03
参考案例
1
案例一
分别构建靶基因CADM1双荧光素酶报告基因载体以及与miR-XX结合位点突变的突变体：PGLOCADM1 WT和PGLO-CADM1 MUT。将两种报告质粒与过表达质粒miR-XX mimic和阴性对照质粒分别 共转染至肝癌细胞Huh7中，转染24 h后裂解细胞，12000 rpm离心1 min，收集上清。使用双荧光素酶 报告基因检测系统 (Dual-Luciferase® Reporter Assay System，E1910，Promega) 检测荧光素酶活性 。每个细胞样品中加入100 μL萤火虫荧光素酶工作液检测萤火虫荧光素酶 (Firely lueiferase)，加入100 μL海肾荧光素酶工作液检测海肾荧光素酶 (Renilla lueiferase)，以萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶作为 相对荧光素酶活性。实验重复3次。
luminometer荧光检测仪 (PTroimpe：ga公此司)处检测使荧用光素的酶活是性，固每定组实的验重细复三胞次。
20
要学会做科学中的粗活 要研究事实，对比事实，积聚事实
专业
载体以及与目标分
子结合位点突变的
突变体。
2 共转染
将两种报告质粒、过 表达质粒以及阴性对 照质粒分别共转染至 细胞中，转染24 h后 裂解细胞，12000 rpm离心1 min，收 集上清。
3 检测荧光素酶活性
每个细胞样品中加入 100 μL萤火虫荧光素 酶工作液检测萤火虫 荧光素，加入100 μL 海肾荧光素酶工作液 检测海肾荧光素酶 ， 实验重复3次。
5
01
实验原理
3 双荧光素酶报告实验结果
与NC mimic组比较，CELF2野生型3'UTR的荧光素酶活性被miR-451显著抑制 (P < 0.05)，而突变型3'UTR的荧光素酶活性无显著差异 (P > 0.05)。 说明miR-451能特异结合CELF2-3'UTR并在转录后水平下调CELF2基因表达。
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02
实验步骤
3
注意事项
载体
萤火虫荧光素酶建议 选取pGL-3或pGL-4 的载体或自己构建相 应的载体。 海肾荧光素酶建议选 取phRL-TK或pGL-4 代载体或自己构建相 应的载体。 载体比例根据实验具 体情况调整。
细胞
细胞培养时间不宜 过长，12-36h内 最好；长时间培养 后，细胞难裂解。
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03
参考案例
1
案例一
分别构建靶基因CADM1双荧光素酶报告基因载体以及与miR-XX结合位点突变的突变体：PGLO-
CADM1 WT和PGLO-CADM1 MUT。将两种报告质粒与过表达质粒miR-XX mimic和阴性对照质粒分别
共转染至肝癌细胞Huh7中，转染24 h后裂解细胞，12000 rpm离心1 min，收集上清。使用双荧光素酶
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目录
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实验原理 实验步骤 参考案例
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02
实验步骤
1
大致流程
2
重点步骤
3
注意事项
8
02
实验步骤
1
大致流程
转染宿主细胞 检测报告基因荧光强度
提取重组萤火虫荧光 素酶报告基因载体
筛选阳性克隆，测序
构建含调控元件序列的 荧光酶报告基因载体
9
02
实验步骤
2
重百度文库步骤
1 构建载体
分别构建靶基因双 荧光素酶报告基因
相对荧光素酶活性。实验Ti重p复：3次此。处使用的是实验中相应的肿瘤细胞
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03
参考案例
1
案例一
分别构建靶基因CADM1双荧光素酶报告基因载体以及与miR-XX结合位点突变的突变体：PGLO-
CADM1 WT和PGLO-CADM1 MUT。将两种报告质粒与过表达质粒miR-XX和阴性对照质粒分别共转染
· 对象： 一般用HEK-293T细胞，也可使用实验中相应的肿瘤细胞。 · 应用： 靶向结合关系验证
· 优点： 蛋白不需要翻译后加工，所以一旦翻译后立即产生报告活性，检测快速；光产 物具有最高的量子效率，因而非常灵敏。
4
01
实验原理
2 双荧光素酶报告实验原理
当我们感兴趣的miRNA和质粒中的插 入序列结合后，miRNA会通过和所插入 的序列结合从而抑制萤火虫荧光蛋白的翻 译最终造成荧光值的下降。海肾素荧光蛋 （renilla luciferase）是作为内参来去除 组间的转染效率差异的。其实你也可以理 解为：用荧光值来判断miRNA是否和靶 基因结合。
荧光素酶工作液检测海肾荧光素酶 (Renilla lueiferase)，以萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶作为相对荧
光素酶活性。实验重复3次。
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参考案例
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案例二
生物信息学进行LINC01082和miR-XX结合关系的分析，利用荧光素酶报告法验证miR-XX是 LINC01082的直接靶点，人工合成LINC01082基因片段利用内切酶位点SpeI 和Hind III 引入pMIRreporter (北京华越洋生物科技有限公司) 中，在LINC01082野生型上设计种子序列的互补序列突变位点 ，通过限制性内切酶酶切后使用T4 DNA 连接酶将目的片段插入到pMIR-reporter 报告质粒中。将测序 正确的荧光素酶报告质粒WT和MUT分别与miR-XX共转染至细胞HEK-293T (上海北诺生物科技有限公司) 中。转染48 h后收集并裂解细胞，使用荧光素酶检测试剂盒 (K801-200，Biovision 公司) Glomax20/20 luminometer荧光检测仪 (Promega公司) 检测荧光素酶活性，每组实验重复三次。
专业
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实验原理 实验步骤 参考案例
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实验原理 实验步骤 参考案例
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实验简介
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实验结果图
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实验原理
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实验简介
· 介绍：是通过将预测能够与miRNA结合的靶基因3’UTR序列插入载体中萤火虫荧光蛋 白（firefly luciferase）的3’UTR。
Step3：检测荧光素酶活性 至肝癌细胞Huh7中，转染24 h后裂解细胞，12000 rpm离心1 min，收集上清。使用双荧光素酶报告基
因检测系统 (Dual-Luciferase® Reporter Assay System，E1910，Promega) 检测荧光素酶活性。每个
细胞样品中加入100 μL萤火虫荧光素酶工作液检测萤火虫荧光素酶 (Firely lueiferase)，加入100 μL海肾
报告基因检测系统 (Dual-Luciferase® Reporter Assay System，E1910，Promega) 检测荧光素酶活性
。每个细胞样品中加入100 μL萤火虫荧光素酶工作液检测萤火虫荧光素酶 (Firely lueiferase)，加入100
Step2：共转染 μL海肾荧光素酶工作液检测海肾荧光素酶 (Renilla lueiferase)，以萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶作为
反应
双荧光素酶反应体 积：20ul（细胞裂 解产物）-100ul（ 萤火虫荧光素酶底 物）-100ul（海肾 荧光素酶底物）， 底物量可根据实际 情况调整，但一定 要保证底物过量， 不然会造成检测结 果出现大的偏差。
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实验原理 实验步骤 参考案例
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参考案例
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案例一
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案例二
报告基因检测系统 (Dual-Luciferase® Reporter Assay System，E1910，Promega) 检测荧光素酶活性 。每个细胞样品中加入100 μL萤火虫荧光素酶工作液检测萤火虫荧光素酶 (Firely lueiferase)，加入100 μL海肾荧光素酶工作液检测海肾荧光素酶 (Renilla lueiferase)，以萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶作为 相对荧光素酶活性。实验重复3次。
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参考案例
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案例一
分别构建靶基因CADM1双荧光素酶报告基因载体以及与miR-XX结合位点突变的突变体：PGLOCADM1 WT和PGLO-CADM1 MUT。将两种报告质粒与过表达质粒miR-XX mimic和阴性对照质粒分别
Step1：构建载体 共转染至肝癌细胞Huh7中，转染24 h后裂解细胞，12000 rpm离心1 min，收集上清。使用双荧光素酶
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参考案例
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案例二
生物信息学进行LINC01082和miR-XX结合关系的分析，利用荧光素酶报告法验证miR-XX是 LINC01082的直接靶点，人工合成LINC01082 基因片段利用内切酶位点SpeI 和Hind III 引入pMIRreporter (北京华越洋生物科技有限公司) 中，在LINC01082野生型上设计种子序列的互补序列突变位点 ，通过限制性内切酶酶切后使用T4 DNA 连接酶将目的片段插入到pMIR-reporter 报告质粒中。将测序 正确的荧光素酶报告质粒WT和MUT分别与miR-XX共转染至细胞HEK-293T (上海北诺生物科技有限公司) 中。转染48 h后收集并裂解细胞，使用荧光素酶检测试剂盒 (K801-200，Biovision 公司) Glomax20/20
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参考案例
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案例一
分别构建靶基因CADM1双荧光素酶报告基因载体以及与miR-XX结合位点突变的突变体：PGLOCADM1 WT和PGLO-CADM1 MUT。将两种报告质粒与过表达质粒miR-XX mimic和阴性对照质粒分别 共转染至肝癌细胞Huh7中，转染24 h后裂解细胞，12000 rpm离心1 min，收集上清。使用双荧光素酶 报告基因检测系统 (Dual-Luciferase® Reporter Assay System，E1910，Promega) 检测荧光素酶活性 。每个细胞样品中加入100 μL萤火虫荧光素酶工作液检测萤火虫荧光素酶 (Firely lueiferase)，加入100 μL海肾荧光素酶工作液检测海肾荧光素酶 (Renilla lueiferase)，以萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶作为 相对荧光素酶活性。实验重复3次。
luminometer荧光检测仪 (PTroimpe：ga公此司)处检测使荧用光素的酶活是性，固每定组实的验重细复三胞次。
20
要学会做科学中的粗活 要研究事实，对比事实，积聚事实
专业
载体以及与目标分
子结合位点突变的
突变体。
2 共转染
将两种报告质粒、过 表达质粒以及阴性对 照质粒分别共转染至 细胞中，转染24 h后 裂解细胞，12000 rpm离心1 min，收 集上清。
3 检测荧光素酶活性
每个细胞样品中加入 100 μL萤火虫荧光素 酶工作液检测萤火虫 荧光素，加入100 μL 海肾荧光素酶工作液 检测海肾荧光素酶 ， 实验重复3次。
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实验原理
3 双荧光素酶报告实验结果
与NC mimic组比较，CELF2野生型3'UTR的荧光素酶活性被miR-451显著抑制 (P < 0.05)，而突变型3'UTR的荧光素酶活性无显著差异 (P > 0.05)。 说明miR-451能特异结合CELF2-3'UTR并在转录后水平下调CELF2基因表达。
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实验步骤
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注意事项
载体
萤火虫荧光素酶建议 选取pGL-3或pGL-4 的载体或自己构建相 应的载体。 海肾荧光素酶建议选 取phRL-TK或pGL-4 代载体或自己构建相 应的载体。 载体比例根据实验具 体情况调整。
细胞
细胞培养时间不宜 过长，12-36h内 最好；长时间培养 后，细胞难裂解。
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案例一
分别构建靶基因CADM1双荧光素酶报告基因载体以及与miR-XX结合位点突变的突变体：PGLO-
CADM1 WT和PGLO-CADM1 MUT。将两种报告质粒与过表达质粒miR-XX mimic和阴性对照质粒分别
共转染至肝癌细胞Huh7中，转染24 h后裂解细胞，12000 rpm离心1 min，收集上清。使用双荧光素酶
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实验原理 实验步骤 参考案例
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实验步骤
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大致流程
2
重点步骤
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注意事项
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实验步骤
1
大致流程
转染宿主细胞 检测报告基因荧光强度
提取重组萤火虫荧光 素酶报告基因载体
筛选阳性克隆，测序
构建含调控元件序列的 荧光酶报告基因载体
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实验步骤
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重百度文库步骤
1 构建载体
分别构建靶基因双 荧光素酶报告基因
相对荧光素酶活性。实验Ti重p复：3次此。处使用的是实验中相应的肿瘤细胞
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参考案例
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案例一
分别构建靶基因CADM1双荧光素酶报告基因载体以及与miR-XX结合位点突变的突变体：PGLO-
CADM1 WT和PGLO-CADM1 MUT。将两种报告质粒与过表达质粒miR-XX和阴性对照质粒分别共转染
· 对象： 一般用HEK-293T细胞，也可使用实验中相应的肿瘤细胞。 · 应用： 靶向结合关系验证
· 优点： 蛋白不需要翻译后加工，所以一旦翻译后立即产生报告活性，检测快速；光产 物具有最高的量子效率，因而非常灵敏。
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01
实验原理
2 双荧光素酶报告实验原理
当我们感兴趣的miRNA和质粒中的插 入序列结合后，miRNA会通过和所插入 的序列结合从而抑制萤火虫荧光蛋白的翻 译最终造成荧光值的下降。海肾素荧光蛋 （renilla luciferase）是作为内参来去除 组间的转染效率差异的。其实你也可以理 解为：用荧光值来判断miRNA是否和靶 基因结合。
荧光素酶工作液检测海肾荧光素酶 (Renilla lueiferase)，以萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶作为相对荧
光素酶活性。实验重复3次。
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案例二
生物信息学进行LINC01082和miR-XX结合关系的分析，利用荧光素酶报告法验证miR-XX是 LINC01082的直接靶点，人工合成LINC01082基因片段利用内切酶位点SpeI 和Hind III 引入pMIRreporter (北京华越洋生物科技有限公司) 中，在LINC01082野生型上设计种子序列的互补序列突变位点 ，通过限制性内切酶酶切后使用T4 DNA 连接酶将目的片段插入到pMIR-reporter 报告质粒中。将测序 正确的荧光素酶报告质粒WT和MUT分别与miR-XX共转染至细胞HEK-293T (上海北诺生物科技有限公司) 中。转染48 h后收集并裂解细胞，使用荧光素酶检测试剂盒 (K801-200，Biovision 公司) Glomax20/20 luminometer荧光检测仪 (Promega公司) 检测荧光素酶活性，每组实验重复三次。