分子生物学技术鉴定葡萄酒酵母的方法应用综述

脉冲电泳核型分析（PFGE）
机理：相同菌种不同菌株间的染色体数、核型大小并 不完全相同，存在不同程度的差异。
脉冲电场凝胶电泳可以在琼脂糖凝胶中用电泳分离完 整的酵母染色体DNA 分子，从而测定酵母细胞染色体 条数及其大小。大量研究表明，脉冲电泳核型分析对 酵母属（Saccharomyces）的种内鉴定有着重要的贡 献，并被认为是一种快速、简单、有效的鉴定方法。
核糖体DNA 序列分析
葡萄酒相关酵母的rRNA 基因（rDNA）及转录间区（I TS）的序列是鉴定过程中最为常用的，包括18S rDNA 、26S rDNA 的D1/D2、ITS、5.8S rDNA。由于这些序 列均能在GenBank/EMBL/DDBJ 等国际核酸序列数据库 中查找到，因此通过对特定基因区域的序列比对，就 能够准确地为葡萄酒相关酵母进行分类鉴定。
结束语
综合所述，各种分子生物学技术鉴定葡萄酒酵母的方 法都有各自的优势与劣势， 要想达到满意的鉴定结 果一般都需要结合两种以上的分子鉴定手段， 或是 根据不同的菌种采用特定的鉴定方法。
参 考 文 献
参 考 文 献
[1] 雷崑,黄雅琳.壳聚糖对啤酒中嘌呤的吸附性能[J].安徽农业科学,2006,34(7) : 1431. [2] Nguyen T T, Sporns P, Hadziyev D. Simultaneous liquid chromatography determination of ribonucleoside-5'-monophosphates and their isomers in pota to tubers[J]. J Chromatogr, 1986, 363:361-281. [3] Qureshi A A, Prentice N. Quantitation of potential flavoring compounds i n worts and beers by HPLC[J].J .Am. Soc. Brew.Chem.1979,37(4):153-160. [4] 骆锡能,陈翠瑶.水产品嘌呤含量定量方法的建立[J].食品科学(台湾),1997, 24(1):1-11. [5] 尤玉如,张艳萍,刘士旺.HPLC 法测定啤酒中嘌呤含量的方法研究[J].中国 酿造,2008,3:76-79. [6] 钟晓盈,陆幼兰.利用HPLC 测定啤酒嘌呤含量方法的研究[J].啤酒科技,200 7,3:23-26.
（2）5.8S-ITS rDNA 区序列分析
rDNA 中5.8S 区的长度和序列非常保守， 而ITS 区 的长度和序列则变异较大；根据它们的序列差异， 可以进行对葡萄酒相关酵母菌种的分类鉴定，这种 方法对于亲缘关系较近的菌株间的区分也能够得到 良好的效果。
2003年，Matthias 等人同样利用这种鉴定方法，对贵腐葡萄 酒中的一株耐寒耐渗透性菌C.zemplinina进行了鉴定，并定义 为一株新种[17]。5.8S-ITS rDNA 区序列分析的方法鉴定准确 性很高，是葡萄酒相关酵母分类鉴定中应用最为普遍和频繁的 方法。 2005 年，A.A. Nisiotou 和G.R. Gibson 通过5.8SITSrDNA 区序列分析的方法对希腊市售葡萄酒中潜在的酵母进行了鉴定 和检测， 并且发现这种鉴定方法快速而准确[16]。
2002 年，Josepa Sabate 等人，从西班牙Priorat 产区葡萄酒厂的发酵池表面分离出了3 株酿酒酵母（ S. cerevisiae）菌株，并通过mt DNA-RFLP 的方法 描述了这3 株菌株的种内差异[3]。
DNA 限制性片段多态性分析（PCR-RFLP）
DNA 限制性片段多态性分析是基于DNA和分子杂 交的一项技术，其特异性很强，主要依靠分析 相似系数进行鉴别。对于葡萄酒相关酵母菌的 鉴定来说，酵母5.8SrRNA 基因及两侧的转录间 隔区（internal transcribed spacer,ITS） 的PCR-RFLP使用得最为广泛 [4]。
LOGO
分子生物学技术鉴定葡萄 酒酵母的方法应用综述
葡萄酒的概念
按照国际葡萄酒组织的规定，葡萄酒只能是破碎或未 破碎的新鲜葡萄果实或汁完全或部分酒精发酵后获得 的饮料，其酒精度一般在8.5°到16.2°之间；按照 我国最新的葡萄酒标准GB15037-2006规定，葡萄酒是 以鲜葡萄或葡萄汁为原料，经全部或部分发酵酿制而 成的，酒精度不低于7.0%的酒精饮品。
[7]丁明玉,杨海军,肖善强,等.反相高效液相色谱法直接测定茶水提取物中的嘌 呤碱[J].色谱,1999,17(5):459-461. [8] 霍小敏,屠春燕,宋慧敏,等.HPLC法测定酵母RNA 降解的4种核苷酸[J].南 京工业大学学报,2002,24(4):61-64. [9]Andrea SKELIN, Sanja SIKORA, Sandi ORLI, Lejla DURAKOVI, Sulejman REDEPOVI. Genetic Diversity of Indigenous Saccharomyces sensu stricto Yeasts Isolated from Southern Croatia[J]. Agriculturae Conspectus Scientifi cus,2008,73 (2):89-94. [10]白逢彦, 贾建华. 脉冲电泳核型分析在酿酒酵母菌分类学研究中的应用[J]. 微生物学报, 2000, 40:9-13. [11]夏青,谢田,文红梅,刘永翔. 8株国外引进的酿酒酵母菌的分类鉴定[J].贵州 农业科学,2007,35(2):15-19. [12]F.DELLAGLIO,.G.ZAPPAROLI, P.MALACRINò , G.SUZZI,S.TORRIANI.Saccharomyces bayanus var. uvarum and Saccharomyces cerevisiae succession during spontaneous fermentations of Recioto and Amarone wines.
4）含有能消除脂肪的单宁， 可使血Fra Baidu bibliotek保持弱碱性，强化 微血管让皮肤维持柔嫩弹性。
2)可减少25%-45%的心肌梗塞 发病率。
5）葡萄酒能补充铁质，预防 骨质疏松。
3）对脑血管疾病，如中风等 有降低发病率的效果。
6）每日饮用适量葡萄酒的老 人，其精神与智力反应，比 滴酒不沾或酗酒的老人佳。
红酒的制作工艺
其他分子鉴定方法
线粒体DNA 限制性酶切分析
该法根据不同酵母菌种具有种内独特的mtDNA 限制性图谱，通过比较各自的酶切物理图谱 ，根据限制性片段在不同群体中的共享度计 算遗传距离，该法适用于近缘种群间的鉴定 或种内群体的比较[1]。
2000 年，Giuseppe Comi等人利用mt DNA-RFLP 分析 对意大利Collio地区本土酿酒酵母种内生物多样性进 行评价，显示本土酿酒酵母的遗传多样性[2]。
同年，中国食品发酵工业研究院的李金霞等人同样利用该分析 法对中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC) 保藏的22 株酿 酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和1 株威尔酵母(S.willi anus)进行了复核鉴定，结果表明，该方法能够应用于酿酒酵 母的分子生物学鉴定[14]。
2000 年，中国科学院微生物研究所白逢彦通过脉冲电场凝胶电泳分 析发现酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、贝酵母(S.bayanus) 和巴氏酵母(S. pastorianus)三者与少孢酵母(S. exiguus) 在电泳 核型上具有明显的差异，并重新为某些菌株定义了分类和种属[9]。 2003 年，F.Dellaglio 等人对葡萄酒自然发酵过程中分离得到的一 种变种酵母（Saccharomycesbayanus var. uvarum） 和酿酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae）的分子鉴定过程中也用到了脉冲电场 凝胶电泳（PFGE）的方法，并且得到了较好的结果[11]。 2007 年，贵州大学的夏青等人通过传统分类鉴定方法和脉冲电场凝 胶电泳（PFGE）相结合，鉴定出了8 株国外引进的酿酒酵母菌的种 属[10]。
2007年，西北农林科技大学苏龙等人对中国东北山葡萄酒产区 山葡萄酒自然发酵过程分离得到的酵母进行5.8S rDNA基因的R FLP 分析，得到19 种酶切图谱，表现了东北山葡萄酒产区葡 萄酒相关酵母的多样性[6]。
随机扩增多态性DNA分析
其原理是利用大约10 个碱基的随机引物以PCR 技术 为基础，对整个基因组DNA 进行扩增，得到多个片断 ，再利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检测个体间扩 增出的片断的多态性，可以辨别出菌株间基因组DNA 内核苷酸序列存在的微小变异[7]。
葡萄酒有许多分类方式。以成品颜色来说，可分为红 葡萄酒、白葡萄酒及粉红葡萄酒三类。其中红葡萄酒 又可细分为干红葡萄酒、半干红葡萄酒、半甜红葡萄 酒和甜红葡萄酒，白葡萄酒则细分为干白葡萄酒、半 干白葡萄酒、半甜白葡萄酒和甜白葡萄酒。
功能效用
1)增加生活情趣以葡萄酒佐 餐可以使用餐速度放慢,心情 自然比较轻松愉悦
其他分子鉴定方法
近年来，随着分子生物技术手段的发展，新的鉴定葡萄酒相关 酵母菌种的方法也有所发展，如实时PCR 技术（Real time PC R），它是一项基于稳定遗传特性的技术，可以特异性地鉴定 酵母菌种类。2007 年，Hierro 等人指出实时PCR 技术能够无 需酵母菌种的预培养即可达到鉴定的目的， 是一种方便而快 捷的鉴定手段[18]。另外，TRFLP，ARISA 及DNA 重组探针的 指纹图谱技术和微卫星分子标记技术对葡萄酒相关酵母菌种的 鉴定也能够达到较好的效果。
（1）26S rDNA D1/D2 区序列分析
研究表明，26S rDNA 的Dl/D2 区域具有较高的变异 率，可以用于亲缘关系较近的菌株之间的分类研究。 一般同一个种的不同菌株其碱基差异一般不超过1%， 而属于不同种的菌株其核苷酸序列差异一般较大， 根据这一标准，可以将绝大部分种区分开。
2003 年，Harry vanKeulen 等人也是通过这种方法，将美国L ake Erie 地区霞多丽、雷司令、灰比诺葡萄自然发酵过程中 分离出的酵母属的菌株和野生酵母菌种进行了分类鉴定[15]。 2007 年， 西北农林科技大学徐艳文等人通过26SrDNA 的Dl/D 2 区域分析的方法， 分析鉴定了自甘肃莫高葡萄酒厂分离的2 9 株非酿酒酵母菌，证明此方法在葡萄酿酒酵母菌种多样性研 究中良好的应用价值[13]。
以红葡萄酒的制作为例 第一，去梗 第二，压榨果粒 第三，发酵
其他葡萄酒的制作程序相差不多，主要在选择 品种和发酵两个程序上有所不同。
葡萄酒相关酵母菌的分子生物 学鉴定方法及研究进展
图示
线粒体DNA限制性酶切分析
DNA限制性片段多态性分析
随机扩增多态性DNA
图示
脉冲电泳核型分析（PFGE）
核糖体DNA 序列分析
1999 年，Esteve-Zarzoso等人首次利用该DNA区域具有显著的 种间差异性的特点，发现不同种的酵母菌对应不同的酶切图谱 ，并建立了基于5.8SrDNA-ITS 的RFLP 分析的酵母菌种的数据 库，并确定了5.8S-ITS 扩增片段的RFLP 分析在种的水平上鉴 定酵母菌的有效性[5]。
2008 年，Barbara Bovo 等人通过RAPD 的方法对格拉巴酒酿制过 程中分离出的酵母菌株进行了鉴定，将分离出的70 株菌株鉴定到 了种的水平，显示了高度的生物多样性。作者还指出了RAPD 的鉴 定方法的重现性达到了96 %以上[8]。
同年，Andrea Skelin 等人通过RAPD 的方法对克罗地亚南部分离 得到的酵母属的酵母进行了分子鉴定。他们采用的是PCR-RFLP 和 RAPD 相结合的方法，研究发现PCR-RFLP 只能将酵母菌鉴定到种 的水平， 继而采用RAPD 的方法能鉴定到菌株的水平[9]。RAPD 的方法也是一种较为常用的、简便的酵母菌种鉴定方法。