冬凌草不同部位甲素的含量
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冬 凌 草 样 品 野 生 样 品 采 自 河 南 济 源 市 五 龙 口 镇 经 陈 随 清 鉴 定 为 Rabdosia rubescens(Hemsl.)S.Y.Wu et Hsuen 人工栽培样品采自济源市 冬凌草规范化种植示范基 地 科技部 十五 攻关课题 采集时间 2003 年 6 月 29 日
冬凌草甲素 98.4% 97.9% 96.8% 100.2% 102.8% 平均回收率 99.22% (n=5) RSD=2.37%
2.9 样品含量测定结果
精密称取冬凌草样品粗粉 按 2.3 项供试品溶液的制备方法制备供试液 吸取 5ul 注入
液相色谱仪测定,计算样品中迷迭香酸的含量 见表 4
表 4 冬凌草不同部位中迷迭香酸 冬凌草甲素的含量 n=3
3 讨论 3.1 冬凌草为多年生半灌木植物 7 月份以前当年生的地上茎为草质 以后逐渐木质化 叶也 脱落 对于冬凌草的入药部位 文献记载也不一致 中华人民共和国卫生部药材标准 冬凌草 以“干燥叶及地上部分”入药[5] 河南省药材标准 冬凌草以“地上部分”入药[6] 但在实际采收 时 常割其地上草质部分或只掳其叶 带少量幼茎 因此 在规范化种植研究时 为了确定冬 凌草的入药部位 提高药材质量 我们以迷迭香酸 冬凌草甲素为指标 对冬凌草不同部位的 含量进行了考察 实验结果表明 迷迭香酸 冬凌草甲素主要集中分布在冬凌草叶中 所以建 议在冬凌草采收时可以单采其叶 或为了采收方便割其地上草质部分 3.2 本文采用 HPLC 法测定冬凌草中迷迭香酸 冬凌草甲素的含量 实验对样品液制备条件进 行了考察 分别用甲醇 丙酮作提取溶剂 以索氏提取器连续回流提取 4h 6h 8h 或分别超 声提取 40 分钟 60 分钟 80 分钟 结果表明 相同条件下 用甲醇提取测得迷迭香酸 冬凌 草甲素的含量明显高于用丙酮提取测得迷迭香酸 冬凌草甲素的含量 与用甲醇作溶媒索氏提 取相比 超声法具有含杂质少 提取时间短等优点 用甲醇超声提取 60 分钟和用甲醇超声提取 80 分钟测得迷迭香酸冬凌草甲素的含量无明显差异 故以甲醇超声提取 60 分钟为最佳提取条 件 故含量测定时的样品处理采用超声 60 分钟提取的方法 本文采用的实验条件稳定 实验重 复性好 结果可靠 参考文献 1.河南省医学科学研究所药理药化组 冬凌草素的化学及药理作用研究 中草药通讯 1977,(10):
HPLC 流动相用甲醇为色谱纯 其它试剂均为分析纯 2 实验方法与结果 2.1 标准溶液的配制
精密称取冬凌草甲素和迷迭香酸对照品 分别加甲醇配制成浓度为 1.10mg/ml 1.04mg/ml 的
1
溶液 2.2 测定条件 流动相 甲醇 0.5%磷酸水溶液 50:50,色谱柱:岛津 Shimpack CLC-ODS 柱 6.0 150mm , 柱温 30 ,检测波长:335nm,流速 0.8ml/min
2h 4h
86766 2056378 2197824 2145375 2178345 2.71
冬凌草甲素 1844902 1875971 1903991 1928905 1908117 1946212 1.92
2.7 重复性试验
取供试品 按供试品溶液的制备方法制备 5 份供试溶液 分别进样 5ul 按样品的测定方法
部位
迷迭香酸含量 %
冬凌草甲素 %
3
草质茎叶 叶
草质茎 木质化茎
02 6 2 02 6 29 02 8 1 02 8 31 02 10 2 野生 人工栽培 0.635 0.911 1.636 1.782 0.248 0.057 0.185 0.028
野生 人工栽培 0.474 0.679 0.867 1.499 0.064 0.012 0.056 0.032
冬凌草甲素 y=514743592.80x+58056.84 r=0.9998,线性范围 1.10 11.0µg
2.5 精密度试验
2
精密吸取对照品溶液 5ul 连续测定 5 次 测其峰面积 计算 RSD % 值 结果见表 1
表 1 精密度试验结果
实验号
1
2
3
4
5
RSD %
迷迭香酸 1978705 2059437 2129085 1994274 2058916 2.94
冬凌草甲素 1844902 1803991 1890434 1875971 1899981 1.27
2.6 稳定性试验
取供试品溶液于 0 1 2 4 8 24 小时分别进样 5 l 测其峰面积 计算 RSD % 值
结果见表 2 结果表明供试品溶液 24 小时内稳定
表 2 稳定性试验结果
测定时间
0h
1h
冬凌草不同部位迷迭香酸及冬凌草甲素的含量测定
陈随清 冯卫生 董诚明 王丽 董三丽
河南中医学院 450008
冬凌草(Rabdosia rubescens (Hemsl.) S.Y.Wu et Hsuem)为唇形科香茶菜属植物 广 布于我国黄河 长江流域 主产于河南济源太行山区 味甘苦 性微寒 具清热解毒 消炎止 痛及抗肿瘤之功效 长期以来 有关冬凌草化学成分及药理的研究主要集中在脂溶性部位 代 表性成分为冬凌草甲素 冬凌草乙素等[1-2] 但河南民间用于治疗咽喉肿疼 食管癌等已有 50 余年历史 皆以泡茶 煮水的形式服用 临床报道其水及醇提取物对食管癌 贲门癌 肝癌 乳腺癌有一定疗效[3] 因此 近几年我们一直致力于冬凌草水溶性成分的研究 先后从冬凌草水 溶性部位分离出三种化合物 迷迭香酸(rosmarinic acid) enmenol-1 -glucoside 及 2 7二羟基-2 3-二氢色原酮等 实验证明 迷迭香酸具有较好的抗菌 消炎 止痛的功效 是其 水溶性部位主要的有效成分[4]
冬凌草一直处于野生状态,太行山区石多土少,气候干旱,冬凌草生长环境较差,因此产量 很不稳定 随着冬凌草茶 冬凌草含片 冬凌草片等中成药的生产量扩大 对冬凌草野生资源 的破坏越来越严重 因此 2002 年我们承担了国家科技部 十五 攻关项目 冬凌草的规范化 种植 在进行冬凌草规范化种植研究中 我们首先对冬凌草不同部位迷迭香酸及冬凌草甲素 的含量进行了测定 以便为确定冬凌草的入药部位提供科学依据 现报道如下
进行测定 计算供试品溶液浓度及 RSD % 值 结果见表 3
表 3 重复性试验结果表 ug/ l
实验号
1
2
3
4
5
RSD %
迷迭香酸 0.1495 0.1578 0.1488 0.1518 0.1550 2.48
冬凌草甲素 0.1037 0.1061 0.1086 0.1009 0.1085 1.56
科技部十五攻关课题 编号 2001BA701A23 05
5
2.8 加样回收率试验
精密称取已知含量的冬凌草样品 5 份 分别加入精密称定的迷迭香酸 1.5mg 1.5mg 3mg
4mg 4mg 冬凌草甲素 2mg 2mg 3mg 4mg 4mg 按 2.3 项供试品溶液的制备方法制备供试液
取 5ul 注入液相色谱仪测定,计算加样回收率
迷迭香酸 97.2% 96.5% 102.0% 98.3% 98.8% 平均回收率 98.56% (n=5) RSD=2.16%
2.晁金华 赵清治 王汉清 等 冬凌草抗癌有效成分提取流程的部分改革 河南医学院学报
4
1981;16(1):286 3. 阴健等 中药现代研究与临床应用 学苑出版社 4. 陈随清 董诚明 郑晓珂 等.冬凌草不同采收期迷迭香酸的含量变化.河南中医学院学报 2003 18 6 29 5.卫生部药典委员会编.华人民共和国卫生部药品标准.中药材 6.河南省卫生厅编.河南省中药材标准 中原农民出版社 1992.3:32-34
25ml 的容量瓶中 备用
2.4 线性关系考察
分别精密吸取各标准品溶液 1 ul, 2 ul, 4 ul, 8 ul, 10 ul 注入液相色谱仪中 测定其
峰面积 以峰面积值 y 为纵坐标 进样量(x)为横坐标作图 得到一条不经过原点的直线
计算其回归方程
迷迭香酸 y=4895848.42x+36751.57 r=0.9996, 线性范围 1.04 10.4µg
实验部分 1 仪器 药品
1.1 仪器 日本岛津 LC-10AD 高效液相色谱仪 SPD-10AD 紫外检测器 CR-7A 数据处理 机 CQ-25D 型超声波清洗器 上海超声波仪器厂 1.2 药品 迷迭香酸 冬凌草甲素标准品由本实验室提供(经红外 紫外 核磁鉴定 本文 HPLC 条件测定的纯度分别为 99.3 98.9%)
A
B
C
D
图 1 供试品及标准品 HPLC 色谱图
A 冬凌草供试品
B 迷迭香酸标准品
C 冬凌草甲素标准品
D 阴性对照
2.3 供试品溶液的制备
取冬凌草粉末约 1g 精密称定,以甲醇为溶剂 用超声波提取法进行提取 共分两次提取
每次 30min 每次加甲醇 20ml,最后合并两次的滤液 在蒸发皿内挥干溶剂后 再用甲醇定容在
冬凌草甲素 98.4% 97.9% 96.8% 100.2% 102.8% 平均回收率 99.22% (n=5) RSD=2.37%
2.9 样品含量测定结果
精密称取冬凌草样品粗粉 按 2.3 项供试品溶液的制备方法制备供试液 吸取 5ul 注入
液相色谱仪测定,计算样品中迷迭香酸的含量 见表 4
表 4 冬凌草不同部位中迷迭香酸 冬凌草甲素的含量 n=3
3 讨论 3.1 冬凌草为多年生半灌木植物 7 月份以前当年生的地上茎为草质 以后逐渐木质化 叶也 脱落 对于冬凌草的入药部位 文献记载也不一致 中华人民共和国卫生部药材标准 冬凌草 以“干燥叶及地上部分”入药[5] 河南省药材标准 冬凌草以“地上部分”入药[6] 但在实际采收 时 常割其地上草质部分或只掳其叶 带少量幼茎 因此 在规范化种植研究时 为了确定冬 凌草的入药部位 提高药材质量 我们以迷迭香酸 冬凌草甲素为指标 对冬凌草不同部位的 含量进行了考察 实验结果表明 迷迭香酸 冬凌草甲素主要集中分布在冬凌草叶中 所以建 议在冬凌草采收时可以单采其叶 或为了采收方便割其地上草质部分 3.2 本文采用 HPLC 法测定冬凌草中迷迭香酸 冬凌草甲素的含量 实验对样品液制备条件进 行了考察 分别用甲醇 丙酮作提取溶剂 以索氏提取器连续回流提取 4h 6h 8h 或分别超 声提取 40 分钟 60 分钟 80 分钟 结果表明 相同条件下 用甲醇提取测得迷迭香酸 冬凌 草甲素的含量明显高于用丙酮提取测得迷迭香酸 冬凌草甲素的含量 与用甲醇作溶媒索氏提 取相比 超声法具有含杂质少 提取时间短等优点 用甲醇超声提取 60 分钟和用甲醇超声提取 80 分钟测得迷迭香酸冬凌草甲素的含量无明显差异 故以甲醇超声提取 60 分钟为最佳提取条 件 故含量测定时的样品处理采用超声 60 分钟提取的方法 本文采用的实验条件稳定 实验重 复性好 结果可靠 参考文献 1.河南省医学科学研究所药理药化组 冬凌草素的化学及药理作用研究 中草药通讯 1977,(10):
HPLC 流动相用甲醇为色谱纯 其它试剂均为分析纯 2 实验方法与结果 2.1 标准溶液的配制
精密称取冬凌草甲素和迷迭香酸对照品 分别加甲醇配制成浓度为 1.10mg/ml 1.04mg/ml 的
1
溶液 2.2 测定条件 流动相 甲醇 0.5%磷酸水溶液 50:50,色谱柱:岛津 Shimpack CLC-ODS 柱 6.0 150mm , 柱温 30 ,检测波长:335nm,流速 0.8ml/min
2h 4h
86766 2056378 2197824 2145375 2178345 2.71
冬凌草甲素 1844902 1875971 1903991 1928905 1908117 1946212 1.92
2.7 重复性试验
取供试品 按供试品溶液的制备方法制备 5 份供试溶液 分别进样 5ul 按样品的测定方法
部位
迷迭香酸含量 %
冬凌草甲素 %
3
草质茎叶 叶
草质茎 木质化茎
02 6 2 02 6 29 02 8 1 02 8 31 02 10 2 野生 人工栽培 0.635 0.911 1.636 1.782 0.248 0.057 0.185 0.028
野生 人工栽培 0.474 0.679 0.867 1.499 0.064 0.012 0.056 0.032
冬凌草甲素 y=514743592.80x+58056.84 r=0.9998,线性范围 1.10 11.0µg
2.5 精密度试验
2
精密吸取对照品溶液 5ul 连续测定 5 次 测其峰面积 计算 RSD % 值 结果见表 1
表 1 精密度试验结果
实验号
1
2
3
4
5
RSD %
迷迭香酸 1978705 2059437 2129085 1994274 2058916 2.94
冬凌草甲素 1844902 1803991 1890434 1875971 1899981 1.27
2.6 稳定性试验
取供试品溶液于 0 1 2 4 8 24 小时分别进样 5 l 测其峰面积 计算 RSD % 值
结果见表 2 结果表明供试品溶液 24 小时内稳定
表 2 稳定性试验结果
测定时间
0h
1h
冬凌草不同部位迷迭香酸及冬凌草甲素的含量测定
陈随清 冯卫生 董诚明 王丽 董三丽
河南中医学院 450008
冬凌草(Rabdosia rubescens (Hemsl.) S.Y.Wu et Hsuem)为唇形科香茶菜属植物 广 布于我国黄河 长江流域 主产于河南济源太行山区 味甘苦 性微寒 具清热解毒 消炎止 痛及抗肿瘤之功效 长期以来 有关冬凌草化学成分及药理的研究主要集中在脂溶性部位 代 表性成分为冬凌草甲素 冬凌草乙素等[1-2] 但河南民间用于治疗咽喉肿疼 食管癌等已有 50 余年历史 皆以泡茶 煮水的形式服用 临床报道其水及醇提取物对食管癌 贲门癌 肝癌 乳腺癌有一定疗效[3] 因此 近几年我们一直致力于冬凌草水溶性成分的研究 先后从冬凌草水 溶性部位分离出三种化合物 迷迭香酸(rosmarinic acid) enmenol-1 -glucoside 及 2 7二羟基-2 3-二氢色原酮等 实验证明 迷迭香酸具有较好的抗菌 消炎 止痛的功效 是其 水溶性部位主要的有效成分[4]
冬凌草一直处于野生状态,太行山区石多土少,气候干旱,冬凌草生长环境较差,因此产量 很不稳定 随着冬凌草茶 冬凌草含片 冬凌草片等中成药的生产量扩大 对冬凌草野生资源 的破坏越来越严重 因此 2002 年我们承担了国家科技部 十五 攻关项目 冬凌草的规范化 种植 在进行冬凌草规范化种植研究中 我们首先对冬凌草不同部位迷迭香酸及冬凌草甲素 的含量进行了测定 以便为确定冬凌草的入药部位提供科学依据 现报道如下
进行测定 计算供试品溶液浓度及 RSD % 值 结果见表 3
表 3 重复性试验结果表 ug/ l
实验号
1
2
3
4
5
RSD %
迷迭香酸 0.1495 0.1578 0.1488 0.1518 0.1550 2.48
冬凌草甲素 0.1037 0.1061 0.1086 0.1009 0.1085 1.56
科技部十五攻关课题 编号 2001BA701A23 05
5
2.8 加样回收率试验
精密称取已知含量的冬凌草样品 5 份 分别加入精密称定的迷迭香酸 1.5mg 1.5mg 3mg
4mg 4mg 冬凌草甲素 2mg 2mg 3mg 4mg 4mg 按 2.3 项供试品溶液的制备方法制备供试液
取 5ul 注入液相色谱仪测定,计算加样回收率
迷迭香酸 97.2% 96.5% 102.0% 98.3% 98.8% 平均回收率 98.56% (n=5) RSD=2.16%
2.晁金华 赵清治 王汉清 等 冬凌草抗癌有效成分提取流程的部分改革 河南医学院学报
4
1981;16(1):286 3. 阴健等 中药现代研究与临床应用 学苑出版社 4. 陈随清 董诚明 郑晓珂 等.冬凌草不同采收期迷迭香酸的含量变化.河南中医学院学报 2003 18 6 29 5.卫生部药典委员会编.华人民共和国卫生部药品标准.中药材 6.河南省卫生厅编.河南省中药材标准 中原农民出版社 1992.3:32-34
25ml 的容量瓶中 备用
2.4 线性关系考察
分别精密吸取各标准品溶液 1 ul, 2 ul, 4 ul, 8 ul, 10 ul 注入液相色谱仪中 测定其
峰面积 以峰面积值 y 为纵坐标 进样量(x)为横坐标作图 得到一条不经过原点的直线
计算其回归方程
迷迭香酸 y=4895848.42x+36751.57 r=0.9996, 线性范围 1.04 10.4µg
实验部分 1 仪器 药品
1.1 仪器 日本岛津 LC-10AD 高效液相色谱仪 SPD-10AD 紫外检测器 CR-7A 数据处理 机 CQ-25D 型超声波清洗器 上海超声波仪器厂 1.2 药品 迷迭香酸 冬凌草甲素标准品由本实验室提供(经红外 紫外 核磁鉴定 本文 HPLC 条件测定的纯度分别为 99.3 98.9%)
A
B
C
D
图 1 供试品及标准品 HPLC 色谱图
A 冬凌草供试品
B 迷迭香酸标准品
C 冬凌草甲素标准品
D 阴性对照
2.3 供试品溶液的制备
取冬凌草粉末约 1g 精密称定,以甲醇为溶剂 用超声波提取法进行提取 共分两次提取
每次 30min 每次加甲醇 20ml,最后合并两次的滤液 在蒸发皿内挥干溶剂后 再用甲醇定容在