MTT比色试验、克隆形成试验

MTT比色试验应用举例
药物敏感性试验 生物材料细胞毒测定 放射效应测定 冷冻杀伤效应测定 高温杀伤效应测定 激光效应测定 磁场效应测定 补体依赖性细胞毒测定
120
% cell survival
100 80 60 40 20 0 0 1 10 100
M3SP2-pBp M3SP2-PTEN
1000
ATP生物发光法：灵敏度高，与MTT法类似
MTT比色试验
原理
MTT比色试验步骤
接种: 细胞密度103~105/ml, 体积100~200l 培养: 37℃、5％CO2、饱和湿度，培养24h 施加干预因素：培养适当时间（1-5d） 呈色: 终止培养前4～6h，每孔加5mg/ml MTT 20 l，继续培养 溶解: 每孔加DMSO150 l，振荡5min 比色: 492nm波长，测定光吸收值（A） 绘制曲线：以细胞数或作用因素（如药物浓度） 为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制曲线
MTT ASSAY
Cell suspension
Medium
0.68ml 0.9ml 0.9ml 0.9ml
105/ml
3.2 ³ 105/ml 3.2³ 104/ml
104/ml
3.2³ 103/ml
0.32ml
0.1ml 0.1ml 0.1ml
MTT ASSAY
MTT ASSAY
103 3.2³103 3.2³104
MTT ASSAY
常用测定细胞增殖能力的实验方法 ：MTT比色试验、克隆形成试验
常用测定细胞增殖能力的实验方法
活细胞计数法：费时，有一定主观性 MTT比色法：简便，大样本、灵敏度较高，重复性好 结晶紫染色法：与MTT法类似，但步骤多 克隆形成法：反映干细胞增殖能力，周期长 流式细胞术：细胞周期分布，成本高
同位素掺入法：3H-TdR, 125I-UdR掺入DNA，反映S期细 胞活性，精度最高，但有放射性
MTT实验实习
2人为1组，每块96孔板共4人操作 预先接种细胞数: 103、3.2×103 、 104 、 3.2 × 104 、 105/0.2ml/孔 预先常规培养 预先加入MTT0.02ml, 孵育6h 吸出上清液，加入DMSO 0.2ml,振荡5` 490nm比色，手工记录吸光值 绘制曲线，纵轴（A），横轴细胞数 要求交实验报告，包括姓名、学号、实验名称、 目的、原理、方法和结果。实验报告计入成绩
克隆形成试验
概念：克隆指单个细胞在体外持续分裂繁殖6 代以上，其后代所组成的细胞群。光镜下，大 于50个细胞，计数为1个克隆。 方法： 1.平皿克隆形成试验: 适用于贴壁型细胞，如正 常细胞或肿瘤细胞；控制细胞迁移 2.软琼脂克隆形成试验: 适用于肿瘤细胞、转化 细胞和悬浮生长细胞；无细胞迁移；底层为 0.5%琼脂，上层为0.3%琼脂(含细胞)。 用途：多用于药物、放射敏感性试验。
MTX ( ug/L )
¼ Í 14-1¡ MTX¶ Ô M3SP2-pBpº Í M3SP2PTENÏ · ° û µ Ä Ï · ° û ¶ ¾ ³ ÷Ó Ã
100
M3SP2-pBp
% cell survival
80 60 40 20 0 0 1 2 4
M3SP2-PTEN
8
16
Irradiation ( Gy ) Í ¼ 15-2¡ MTT² ¨± È ½ Ï M3SP2-pBpº Í M3SP2-PTENÏ · ° û µ Ä ² ø É ä à ô · Ð Ð Ô
104
105
MTT比色试验注意事项
培养板：贴壁型细胞－平底培养板 悬浮型细胞－U型培养板 细胞密度：不同细胞须选择适当的密度 MTT溶液：4℃避光保存，出现结晶时弃去；部 分细胞需摸索MTT作用最佳浓度和时间 残留血清和培养液会影响吸光值 注意控制吸光值与细胞数之间线性范围，一般 为102～105
平皿克隆形成试验
软琼脂克隆形成试验
1
Surviving Fraction
0.1 0.01 0.001 0.0001
0 1 2 4 8 16
M3SP2-pBp M3SP2-PTEN
Irradiation ( Gy )
¼ Í 15-5¡Biblioteka Baidu¿ Ë Â ¡ Ð Î ³ É ¨ ²È ±½ Ï M3SP2-pBp Í M3SP2-PTENÏ º · ° û µ Ä ø ²É ä à ô · Ð Ð Ô