反应器微载体培养技术及其在疫苗生产中的应用

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反应器微载体培养技术及其在疫苗生产中的应用| 08 Mar 2012
国外反应器微载体培养生产疫苗现状
公司 Baxter Baxter Nederlands Vaccin Instituut (NVI) Aventis GSK 产品 流感（6000L体积）、天花 甲肝(VERO细胞 100L体积灌注培养模式 连续培养200天) 灭活脊髓灰质炎病毒 乙型脑炎病毒 (2000L体积) 脊髓灰质炎病毒 (Vero细胞)
反应器微载体培养技术及其在疫苗生产中的应用
微载体培养的历史

1967年，Van Wezel提出了微载体培养的概念，将SephadexTM (GE Healthcare) DEAE A-50 作为微载体进行细胞培养。 微载体供应厂商：GE Healthcare、SoloHill、Hyclone、Nunc 流感疫苗 VERO细胞 6000L规模。
ST细胞反应器微载体培养生产猪瘟病毒
第3收上清 MARK 种毒

生产猪瘟病毒
– 微载体浓度：3g/L ，cytodex-1；
– ST细胞密度(接毒时)：3×106cells/ml； – 病毒滴度：大于20万家兔感染量/ml ； – 一批疫苗生产能力： 运行近一个月，收获 50万mL的病毒液， 可制备1300万头份苗：50÷ (7500÷200000)=1300万(头份)
进行维持培养并连 续收获换液
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ST细胞反应器微载体培养生产猪瘟病毒
ST细胞反应器微载体(Cytodex-1 )培养实验
经过消化转罐接毒前ST细胞 胞 接种猪瘟病毒72h的ST细胞 接种猪瘟病毒7收后的细
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微载体反应器培养的放大技术-直接法
VERO细胞在新老载体（Cytodex-3 ）之间形成细胞桥,直接转移细胞 通过搅拌将微载体分离 VERO细胞开始在新载体上生长
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微载体反应器培养的放大技术-消化法
MDCK 细胞在Collagen微载体(Solohill ) 上的消化放大过程
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反应器工艺与转瓶培养工艺的对比
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微载体反应器培养的放大技术
直接法(bead to bead)
– 在新老载体之间形成细胞桥，直接转移细胞
消化法。
– 细胞从老载体上解脱下来,悬浮在液体中,然后再吸附在新加入的微载体上
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微载体反应器培养的放大技术的应用
贴壁细胞微载体反应器大规模培养，用于生产疫苗等生物制品
– 通过逐级放大，达到大规模培养，减少生产批次；
– 减少培养基、血清用量；
– 降低批间差异； – 减少设备投入。

生产、收获大量贴壁细胞
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微载体培养的优势
微载体培养兼有贴壁培养和悬浮培养的优点。 比表面积大，例如1g 微载体（Cytodex-1）所能提供的表面积达到 4400cm2的表面积，可供2×109个细胞生长所需要的表面积。 微载体均匀悬浮于培养液中，易于对细胞培养过程进行实时检测、控制和 优化。 适用于批培养、流加培养和灌注培养等多种操作方式。
培养72H 消化15min
培养96H(消化后24H)
培养168H(消化后96H)
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ST细胞反应器微载体培养生产猪瘟病毒
种细胞复苏 （方瓶）
细胞扩增（转瓶； 细胞工厂）
120L反应器培养
微载体球转球消化 放大工艺
50L反应器培养
接种猪瘟病毒
微载体反应器培养的放大技术的应用

生产、收获大量贴壁细胞—微载体与细胞的分离
– 差速沉降； – 过滤； – 密度梯度离心；
– 流化床分离；
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VERO细胞反应器微载体培养
替代转瓶工艺，满足DISK培养细胞用量。
微载体：Cytodex-1， 5g/L，50L反应器
Solvay Pharmaceuticals(Netherlands)
流感疫苗 (MDCK细胞)
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国外反应器微载体培养生产疫苗现状
流感疫苗 VERO细胞(CytodexTM ) 6000L规模，Baxter Biosciences 。
病毒液的电泳图
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MDCK细胞反应器微载体培养生产流感疫苗
WHO推荐用哺乳动物细胞MDCK替代鸡胚生产流感疫苗
细胞株:MDCK
培养基:DMEM+5%FBS 微载体：Cytodex1 接种密度:10cell/MC
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10L反应器培养
微载体球转球消化 放大工艺
收获毒液
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Marc145细胞反应器微载体培养生产猪蓝耳病毒
Marc145 细胞反应器微载体(Cytodex-1 )培养实验
Marc145细胞生长曲线
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培养体积100L 微载体浓度2.8g/L
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细胞总量(×1010)
消化放大
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批次1 批次2
6
4
2
0 0 2源自文库 48 72 96 120 144 168
培养时间H
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Marc145细胞反应器微载体培养生产猪蓝耳病毒
Marc145 细胞反应器微载体(Cytodex-1 )培养实验
Vero细胞接种密度：4×105cells/ml（15-20cells/MC）
最终细胞密度： 4.5×106cells/ml
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微载体反应器培养的放大技术
直接法 放大比例 适用范围 细胞状态 污染几率 工艺难度 新载体利用率 小（1：1~1：2） 小 损伤小 小 简单 低 消化法 大（可大于1：5） 大 有损伤 小 复杂 高
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MDCK细胞反应器微载体培养生产流感疫苗
细胞株:MDCK 培养基:DMEM+2g/mL TPCK-trypsin 微载体：Cytodex1 5g/L 接种密度:10cell/MC MOI=0.0001
转瓶工艺与反应器微载体培养对比
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– 取代转瓶工艺； – 降低污染风险； – 减少劳动强度；
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Marc145细胞反应器微载体培养生产猪蓝耳病毒
种细胞复苏 微载体球转球消化 放大工艺 120L反应器培养
（方瓶）
细胞扩增（转瓶； 细胞工厂）
50L反应器培养
接种蓝耳病毒