核酸的提取

核酸的提取

核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在，核酸提取的主要步骤为：

裂解细胞

去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，如提取DNA分子时，应去除RNA，反之亦然。

沉淀核酸

纯化核酸，去除盐类，有机剂等杂质

(一)DNA提取的经典方法

DNA提取的经典方法，即所谓的酚-氯仿提取法。因为使用两种不同的有机溶剂交替抽提更容易将蛋白除去，提取次序为酚、酚/氯仿（1：1）、氯仿，这种方法提取的DNA纯度高、片段大、效果好，缺点是较为繁琐。

说明：

回收上层水相时，一定不要接触两相的界面，以免将蛋白质等物质吸入新离心管。

沉淀DNA，无水乙醇是首选的有机溶剂。另：异丙醇、醋酸钠等。

70%乙醇漂洗DNA，是为了去除残余的盐类，去除过量SDS和酚等杂物，因为SDS在70%的乙醇中保持溶解状态，不与DNA共沉淀，从而通过弃上清液去除这种去污剂,避免对以后PCR反应的影响。

TE缓冲液：10mmol/L Tris-Hcl

1mmol/L EDTA pH 8.5或8

RNA的提取

RNA提取条件较DNA要求严格，主要是因为临床标本及实验室环境中，存在大量对RNA 有强烈降解作用RNase。RNase是一类生物活性非常稳定的酶类。这种酶耐酸、耐碱、耐高温，如煮沸也不能使之完全失活。

蛋白质变性剂可使之暂时失活，但变性剂去除后，又可恢复活性。除细胞内RNase以外，环境中灰尘、各种实验器皿和试剂、人体的汗液及唾液中均存在RNase，因此在提取RNA 时，关键要避免RNase对标本的污染及防止RNase对提取的RNA的降解。

1．提取RNA所用器皿的处理及溶液的准备

塑料制品：如试管、EP管、Tip头，使用灭菌的一次性用品。

玻璃用品：如烧杯、试管和其他用品，常被RNase污染，使用前必须于180oC干燥8小时以上，或用0.1轕C水(焦碳酸二乙酯)浸泡处理。

DEPC是RNase的强抑制剂，作用机制是通过与蛋白质中的组氨酸结合，使蛋白质变性。37℃浸泡2小时，然后用灭菌水漂洗数次，于100℃干烤15分钟，去除器皿上残余DEPC。

所需溶液的配制：必须用高压灭菌的水和RNA提取专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药匙称取试剂，把溶液装入无RNase的玻璃器皿。

严格来说，所有溶液均应用0.1轕C于37℃处理12小时以上，然后于100℃加热15分钟或高压灭菌15分钟，去除残余DEPC。

2．RNA提取中RNase污染的控制

最主要的潜在污染源是操作人员的手，手直接触摸之处毫无疑问会留下RNase，另外，说话带出的唾液也富含RNase，故在涉及RNA的一切操作过程中，都应戴一次性手套和口罩。

实验中，如接触了“脏的”玻璃器皿和其他物品以后，手套就可能污染RNase，因此RNA提取实验中，应勤换手套。

RN A提取方法

下面以异硫氰酸胍结合氯仿-酚提取法介绍RNA的提取。

异硫氰酸胍是一种强用力的蛋白质变性剂，能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，核蛋白由于其二级结构的破坏消失而迅速与核酸分离。

RNase虽可耐受多种处理，（如煮沸）而不失活，但却会被4mol/L异硫氰酸胍和-β巯基乙醇（破坏RNase蛋白质中的二硫键）等还原剂所灭活，因而可从组织中分离出完整RNA 分子。

因此上述试剂是制备RNA的常规试剂。

200µl血清（浆）

↓

加入200µl 20%PEG6000

↓

4oC，3小时，12000rpm，4℃离心15分钟

↓

弃上清，加500µl裂解液（含异硫氰酸胍、-β巯基乙醇等），混匀

↓

加50µl NaAc，500µl饱和酚：氯仿：异戊醇（50：49：1），充分混匀，冰浴10分钟

↓

4℃12000rpm，离心5分钟

↓

小心吸取上层水相移至一新离心管中，避免吸取两相之间的蛋白质，用氯仿-异戊醇再抽提

一次

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加2.5倍体积无水乙醇，冰浴30-60分钟

↓

4℃12000rpm，离心10分钟

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弃上清，沉淀用70%乙醇洗二次，65℃烘干

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用10µl DEPC水溶解RNA，并加2u RNasin

↓

-20℃保存备用

（三）核酸提取的其他方法(简单介绍):

胍盐提取结合二氧化硅吸附法

二氧化硅具有特异吸附核酸的特性，异硫氰酸胍可使细胞裂解,因此在高浓度异硫氰酸胍存在下，从细胞(包括细菌)或病毒颗粒中释放出来的核酸成分可以结合在二氧化硅上，利用此特性可提取血液和尿液中DNA和RNA。

2.TRIzol试剂提取RNA方法：

TRIzol试剂盒是由GIBCO BRI公司推出的产品，其操作方法简单方便，一小时内即可完成。用TRIzol试剂裂解细胞，再加入氯仿，离心后可见三层，上层为透明的水相含有RNA，中间层含DNA，下层为红色的有机相，含蛋白质。

3.旋转离心柱提取

旋转离心柱技术是用于微量核酸分离纯化的较为简单的方法，属于硅吸附方法的一种，市场上的离心柱虽各有特色，但在原理上通常可分为三个部分：

利用裂解液促使细胞破碎，使细胞中的核酸释放出来。

把释放出的核酸特异地吸附在特定的硅载体上，这种载体只对核酸有较强的亲和力和吸附力，对其他生化成分如蛋白质、多糖、脂类则基本不吸附，因而在离心时被甩出柱子。

把吸附在特异载体上的核酸用洗脱液洗脱下来，分离得到纯化的核酸。

此法也可用于DNA测序前核酸的纯化，又叫过柱纯化。

旋转离心柱技术具有广泛的发展前景，该产品可应用于生物学、遗传学、免疫学、考古学、法医学等各方面的基因分析。

聚合酶链反应

应用聚合酶链反应（PCR）技术测定临床标本中的病原体核酸成分，是一种高度敏感，且最为直接的检测手段。由于临床标本中含有蛋白质、脂类等物质，可干扰PCR反应，故在做PCR反应前必须进行核酸提取。

经典的核酸提取方法通常是加去污剂（SDS等）裂解细胞，经蛋白酶处理、有机溶剂提取及乙醇沉淀等步骤。

由于样本的处理及保存对DNA和RNA（尤其是RNA）的影响较大，因此在核酸测定时标本的处理及适当保存对测定结果的准确有效非常重要。

临床常见的标本有血清（浆）、全血、分泌物、棉拭子、脓液、体液、新鲜组织、石蜡切片等，这些临床标本的处理和保存方法各有不同。

临床标本的处理

血清（浆）标本