代谢组学及其技术规范

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ROC曲线分析 ROC曲线用于临床诊断：
ROC曲线下的面积值在 1.0 和 0.5 之 间 。 在 AUC>0.5 的 情 况 下 ， AUC越接近于1，说明诊 断 效 果 越 好 。 AUC 在 0.5-0.7时有较低准确性， AUC 在 0.7~0.9 时 有 一 定 准确性， AUC 在 0.9 以上 时 有 较 高 准 确 性 。 AUC=0.5 时 ， 说 明 诊 断 方 法完全 不起 作用， 无 诊 断 价 值 。 AUC<0.5 不 符 合真实 情况 ，在实 际 中极少出现。
标品对照 NIST数据库 HMDB数据库
LC-MS
标品对照 HMDB、 Mass Bank 、C-Clound数据库 已发表文献.
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生物意义阐述
KEGG
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HMDB
已有文献
相关分析
图6 差异代谢物含量热点图（Class 1, 健康对 照下；Class 2，抑郁症组，Class 3逍遥散组， 色带-4-4 代表代谢物含量由高到低）
Hunter 和Chroma TOF等 自主开发设计的软件（基于Matlab或R语言）： MetSign (Anal Chem. 2011 Oct 15;83(20):7668-75.)
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2.3 数据处理
RAW文件
NMR 代 谢 组 学 ， 采 用 MestReNova 软件进行此部分 数据处理
美国加州大学Davis 分校
普渡大学 杜克大学 5/45 等。 国外
中南大学（梁逸曾）
清华大学（罗国安） 上海交通大学（贾伟） 等 国内
1.2 代谢组学分析技术
检测动态范围宽
LC-MS
灵敏度高
利于快速定量分析
灵敏度高
GC-MS
用于挥发性物质检测 检测动态范围窄
NMR
检测动态范围宽 快速、无损 灵敏度低
多元统计分析
代谢物鉴定
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图 1 基于GC-MS尿液代谢组学研究沙棘籽油的抗抑郁作用 代谢通路的分析 生物学意义阐释
谱图的采集
图3 人体血浆样本GC-MS总离子色谱图（TIC） 5 图 负离子模式下各组人体血浆代谢物 LC-MS 总离子流图 图4 图 正离子模式下各组人体血浆代谢物 LC-MS 总离子流 图 2 人体血浆的1H 6.
• 色谱峰检测(峰选择)
• 离子去卷积，按化合物将离子分组 • 利用已有的定制数据库进行化合物鉴定 • 执行数据分析
7.
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2.3 数据处理
数据处理软件： 免费软件：XCMS、MetAlign和 MZmine 等
商品化软件：Water Markerlynx、 Trans Omics、Mass
代谢组学及其技术规范
指导教师: 教
副 教 授 学 专 生： 业：本草生物学
2016.7.20
授
目录
CONTENT
PART 1
PART 2
PART 3
PART 4
代谢组学
技术规范
总结展望
研究内容
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1 代谢组学
1.1 概述 1.2 代谢组学分析技术
1.3 代谢组学数据分析与处理
1.4 代谢组学与中医药 1.5 代谢组学的应用
差异代谢物及相关代谢通路分析
乙醛酸和二羧酸盐代谢
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多元统计分析
可以在不具备样品任 何分组信息的情况下对 数据进行降维处理，使 得样本代谢表型的内在 关系变得可视化。
偏最小二乘-判别分析 （PLS-DA）
主成分分析 （PCA）
聚类 分析
在明确样品分类信息的 前提下，寻找已知组别间的 变量差异或变量之间的相关 关系，找出样品分离的最大 差异，从而最大程度地反映 分类组别之间的差异。
在PLS-DA基础上，去除 正交偏最小二乘 -判别分析 噪音信息，最大化程度地提 （OPLS-DA） 10/45 取与实验有关的变化来寻找 两组之间的差异代谢物。
SIMICA-P MATLAB
代谢物的鉴定
NMR
经验解谱（一维和二维核磁谱图结合） HMDB数据库 现有文献
GC-MS
样本收集
样本储存 分装
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2.2 样本前处理方法 生物组织
前处理方法优化
提取溶剂系统：甲醇/氯仿/水 萃取次数：一步萃取；两步萃取
One step 极性部分 非极性部位
Two step
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2.3 数据处理
1. 2.
• 导入原始的连续数据集 • 峰对齐，纠正不同分析运行间的保留时间偏移 • 色谱峰归一化，以便在不同样品运行间进行比较
标品对照 HMDB、 MetAlign 、C-Clound数据库 已发表文献.
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2.5 代谢通路分析
以D-Glucose为例
D-Glucose
KEGG
MetPA……
Chemical ID ≠ Biochemical ID
代谢通路如何准确定位
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2.5 代谢通路分析
Without labeled tracers, it is impractical to resolve the specific pathway(s) involved in their production.
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1.1 概述
代谢组学是继基因组学，蛋白质组学之后，从整体的角度，通
过研究生物体、器官或组织的内源性代谢物质的代谢途径及其所受 内在环境因素影响及随时间变化规律的一门新兴学科。
代谢物靶标分析：某一类结构性质相关的化合物。 核心思想：运用现代分析技术定量地测定生物体在不同状态下 代谢物指纹分析：同时对多个代谢物进行分析，不分离鉴定具体 （生理病理状态、药物干预前后等）参与物质传递、能量代谢和 研 单一 组分。 究 信息传导等代谢调控的小分子代谢物质即代谢物组的变化，并利 对 代谢物轮廓分析：限定条件下对生物体内特定组织内的代谢产物 象 的快速定性和半定量分析。 用模式识别将这种应答与体内生物学事件相关联，定位事件发生 代谢组分析：对生物体或体内某一特定组织所包含的所有代谢物 的靶器官，从而确定生物标记物，表征或揭示生物体在特定时间、 的定量分析并研究该代谢物组在外界干预或病理生 环境下整体的功能状态。 理条件下的动态变化规律。 4/45
图1 人体血浆1H NMR谱图 图2 三组人体血浆样本的PLS-DA散点图
4.2
1H
NMR代谢组学研究驴胶补血颗粒补血作用机制
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图1 大鼠血清1H NMR谱图
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4.3 GC-MS代谢组学研究沙棘籽油的抗抑郁作用
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4.4 GC-MS代谢组学研究逍遥散的抑郁症疗效
代谢组学研究现状
代谢组学自从出现以来，引起了各国科学家的极大兴趣，短短10年
来取得了突飞猛进的发展，相关科研论文发表数量从1999年的1篇到现在
每年1200多篇是数量增长，主要发表在JPR,、JCB,、PLoS ONE、JPBA 等杂志上，权威科学杂志Nature迄今已有3篇代谢组学相关文章发表。国 内CNKI也从2003年的几篇综述开始到现在已有上千篇出版，并已有相关 书籍出版。 帝国理工大学（Jereny K. Nicholson) 莱顿大学（Van der Greef ) 中科院大连化物所（许国旺） 中科院武汉物理数学研究所（唐慧儒）
4.3 GC-MS代谢组学研究沙棘籽油的抗抑郁作用
4.4 GC-MS代谢组学研究逍遥散的抑郁症疗效 4.5 LC-MS代谢组学研究逍遥散的抑郁症疗效 4.6 临床血浆样本中OT、PGE2、PEF2α的LC-MS测定
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4.1
1H
NMR代谢组学研究逍遥散的抗抑郁疗效
Fig.4.与逍遥散抗抑郁相关的潜在生物标志物ROC 图3 健康对照组以及抑郁症患者治疗前后的 OPLS-DA 散点图以及S-Plots 4 与逍遥散抗抑郁作用相关的代谢通路图 曲线分析. (A) 图 lactate; (B) TAMO; (C) phenylalaine. 30/45
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1.4 代谢组学与中医药
临床诊断
生 物 标 志 物
作用机制
代 谢 通 路
中医理论巨系统且复杂
整体性
动态性 辩证性
中药复方物质基础不明确 16/45
代谢组学
1.5 代谢组学的应用
1
新药的筛选和开发
2
3
药物作用机制研究
药物毒性评价
4 5
疾病诊断与发生机制研究
植物细胞代谢组学研究
6
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微生物代谢组学研究
2 技术规范
2.1 实验设计 2.2 样本前处理方法
2.3 数据处理
2.4 代谢物的鉴定 2.5代谢通路分析
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2.1 实验设计
动 物 实 验
12h 禁食 不禁水
收集 分装
临 床 实 验
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中断晨尿 诊断 排除 12h 禁食 不禁水 静脉血
2.2 样本前处理方法
考察条件 在4℃凝结 在25℃凝结 抗凝剂 样本处理 离心时间 血清储存于4℃ 血清储存于25℃ 血浆储存于4℃ 血浆储存于25℃ 血清储存于-80℃ 冷冻/解冻循环 变化因素 1, 6, 24 h I, 6, 24 h 肝素钠 vs. EDTA vs.柠檬酸钠 I5 min vs. 30min 6, 12, 24, 48 h 6, 12, 24, 48 h 6, 12, 24, 48 h 6, 12, 24, 48 h 1, 3, 6个月 1, 5, 10次 峰面积变化 CV(a)>30% 17.65% 44.8% 66% 8.3% 7.1% 10% 7.1% 10% 3% 2.9%
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1.4 代谢组学与中医药
不良反应比较多
药物价格比较高
西医药治疗
作用靶点较单一 长期用药风险大 成分较多，靶点较多
传统 中医 药治疗
经验用药，配方灵活 作用靶点较多 理想替代治疗 治疗价格便宜 整理调节，安全有效 适合长期服用 资源丰富，价格便宜 服药依从性高
服药依从性不高
不良反应较少
不良反应相对少而轻
多元统计分析
多元统计分析是从经典统计学中发展起来的一个分支，是一种综 合分析方法，它能够在多个对象和多个指标互相关联的情况下分析它 们的统计规律。主要内容包括多元正态分布及其抽样分布、多元正态 总体的均值向量和协方差阵的假设检验、多元方差分析、直线回归与 相关、多元线性回归与相关(Ⅰ)和(Ⅱ)、主成分分析与因子分析、 判别分析与聚类分析、Shannon信息量及其应用。
2
对于样本的收集、处理以及检测等缺乏统一的标准，给代谢组学研究带 来一定的困扰。
3
结合转录组学、蛋白组学及基因组学以及网络药理学等相关系统生物
学技术和方法进一步深入剖析疾病发生以及治疗机制已经成为一种趋势。
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4 研究内容
4.1 4.2
1H 1H
NMR代谢组学研究逍遥散的抗抑郁疗效 NMR代谢组学研究驴胶补血颗粒补血作用机制
图3 健康对照组与抑郁症患者血浆代谢物的OPLS-DA图（A）以及s-plot（B） （左）及其模型验证图（右）
图2
健康对照组以及抑郁症患者服药前后血浆代谢物的PLS-DA散点图
图1 各组人体血浆样本GC-MS总离子色谱图（TIC）
图4 抑郁症患者服药前后样本（训练集）OPLS-DA散点图(a)以及相应的S-plot图（b）； 抑郁症患者服药前后样本（验证集）OPLS-DA散点图（c）以及相应的相应的S-plot图（d） 33/48 33/45
Labeling scheme for the Krebs cycle with pyruvate carboxylation using [U–13C]glucoseas tracer.
J Biomol NMR (2011) 49:267–280.
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3 总结展望
1
代谢组学是组学领域里唯一的表观测量，分析仪器飞速发展，达到了 前所未有的快速、灵敏、可靠和自动化，使得代谢组学中大数据集的 结果更加可靠。
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1.3 代谢组学数据分析与处理
样本的采集 样本的制备
样本的分析
化合物种类多样化 浓度动态范围大 理化性质复杂化 仪器稳定性、精密度、重现性、灵敏度 代谢物分析的全面性 谱峰的校准、归一化、重叠、 数据的标准化 代谢轮廓空间距离的判别 已知及未知代谢物的鉴定 代谢物的去卷积 同分异构体的识别
CDF文件
R软件
GC-MS
csv文件 excel文件 SIMCA-P
LC-MS 代谢组学，一般有工 作站自带网站进行处理
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2.4 代谢物的鉴定
经验解谱（一维和二维核磁谱图结合） HMDB数据库 现有文献
NMR
GC-MS
标品对照 NIST数据库 HMDB数据库
LC-MS