蛋白质芯片

蛋白质芯片的定义
生
基因芯片
蛋白质芯片, 又称蛋白质阵列
物
蛋白质芯片
或蛋白质微阵列，是指以蛋白质
芯
分子作为配基,将其有序地固定
片
微流控芯片
在固相载体的表面形成微阵列； 用标记了荧光的蛋白质或其他它
分子与之作用，洗去未结合的成
分，经荧光扫描等检测方式测定
芯片上各点的荧光强度，来分析
蛋白之间或蛋白与其它分子之间
内容提要
➢蛋白质芯片概述 ➢蛋白质芯片的关键技术 ➢蛋白质芯片的应用 ➢展望
蛋白质的概述
蛋白质芯片，又称为蛋白质微阵列(protein micro array)是大 量的蛋白质分子(例如抗体或抗原分子)或肽链有序排列固定在 载体薄片上形成的。利用蛋白质或肽能特异性地与配体分子 (如抗体或抗原)结合的原理，芯片上的蛋白质分子或肽链与样 品中的相关成分发生反应，然后加入标记分子，并用阅读仪 分析和存储结果，这就是蛋白质芯片的工作原理。构建蛋白 质方阵需解决三个问题，一保持蛋白的活性，二保证蛋白质 正确定位，三与现存的基因微型方阵研究工具相兼容。蛋白 芯片是近年来蛋白质组学研究中兴起的一种新方法。它是在 基因芯片的基础上发展起来的。与传统的研究方法相比有以 下特点：(1)蛋白芯片是一种高通量的研究方法，能在一次实 验中提供大量的信息，使我们能够全而、准确地研究蛋白表 达谱；(2)灵敏度高，它可以检测出蛋白样品中微量蛋白的存 在，检测水平已达ng级；(3)所需的样品量极少。
亲和结合 亲和结合
Agarose thin film 3D gel pad
扩散
蛋白连接强度高、特异和高密度，低背景 蛋白需生物素化
蛋白连接强度高、特异和高密度，低背景 蛋白需His x6标记
表面蛋白分布均一容量
无需蛋白修饰过程，高结合容量
制作难，未商品化
蛋白质芯片的应用
疾病诊断和预警 药物开发 蛋白质组学
蛋白质芯片的分类
➢ 蛋白质检测芯片 ➢ 蛋白质功能芯片
Methods for Protein Analysis
Gel electrophoresis, northern/western blot (fluorescence/radio active label) X-ray crystallography 2D - mass spectrometry Protein microarrays SELDI MS protein chips
源自文库
疾病诊断
定量检测组织提取液中的肿瘤标记物
孵育后的微阵列荧光图 A 含抗原 B 无抗原
uPA 尿激酶型纤溶酶原激活因子 PAI-1血浆纤溶酶原激活因子抑制因子 VEGT 血管内皮生长因子
微阵列方法与ELISA方法检出结果比较
药物开发
高通量筛选蛋白-蛋白作用抑制剂
His6-RB/GST-E7相互作用抑 制剂筛选微阵列图
5.微阵列的封闭
主要封闭试剂：BSA或Gly
蛋白质芯片比较
表面
蛋白固定方式
优点
PVDF Nitrocellulose
吸附 吸附
无需蛋白修饰过程，高结合容量 无需蛋白修饰过程，高结合容量
缺点
非特异吸附，分布随机 非特异吸附，高背景，低密度
Poly-lysine coated 吸附，共
Aldehyde-coated 价偶联
的相互作用关系。
蛋白质芯片的关键技术
1
提出生物学问题
（实验目的）
2
蛋白质芯片制备
6
数据分析和建模
（图象量化，标准化，
采集蛋白信息，建立模型）
检测
（荧光和比色扫描或拍照， 参数设置）
5
样品预处理
3
（重组蛋白，制备一、二级抗体，
荧光标记，配蛋白印记缓冲液）
生化反应
化学偶合，加底物， 反应温度和时间， 冲洗条件
4
蛋白质芯片的制备
1. 固相载体及其处理
载体（滴定板、滤膜、凝胶、载 玻片）
2. 蛋白质的预处理
选择具有较高纯度和完好生物活 性的蛋白进行溶解
3. 点制微阵列
可使用点制基因微阵列的商品化 点样仪或喷墨法等
4.固定微阵列上的蛋 白样点
膜为载体：芯片放入湿盒， 37°C 1h
载玻片为载体：化学修饰产生醛 基固定蛋白
Thank you ！
细胞经oxidized low density lipoprotein作用后的蛋白谱
揭示了oxidized low density lipoprotein 诱导人动脉平滑肌细胞的作用模式
技术难点
成本过高, 需一系列昂贵的尖端仪器
芯片的标准化问题
提高芯片的特异性、简化样品制备和标记操 作程序、增加信号检测的灵敏度和消除芯片 背景对于结果分析的影响等等
加入His6-RB 加入含 PepC抑制剂的 His6-RB A 1500 个点阵的微阵列 B 局部点阵放大图及SPR信号 Jung SO, et al., Proteomics 2005, 5, 4427–4431.
蛋白质组学 人动脉平滑肌细胞蛋白谱
4.7% 抗原（一组细胞-细胞间相 互作用分子）表达上调； 13.4%抗原（结构蛋白，体液响 应蛋白）表达下降
展望—蛋白质芯片未来的发展重点
建立快速、廉价、高通量的蛋白质表达和纯化方法， 高通量制备抗体并定义每种抗体的亲和特异性。
改进基质材料的表面处理技术以减少蛋白质的非特异 性结合。
提高芯片制作的点阵速度；提供合适的温度和湿度以 保持芯片表面蛋白质的稳定性及生物活性。
研究通用的高灵敏度、高分辨率检测方法，实现成像 与数据分析一体化。
Epoxy-activated
PDMS nanowell
共价
偶联
Gold coated silicon
无需蛋白修饰过程，高密度，
非特异吸附，分布随机
高分辨检测
高密度，高分辨检测
分布随机，表面有吸附
高密度，适合复杂的生化分析
高密度，低背景，易与SPR或MS 联用 分布随机，制作难，未商品化
Avidin coated Ni-NTA coated