蛋白质芯片

亲和结合 亲和结合
Agarose thin film 3D gel pad
扩散
蛋白连接强度高、特异和高密度，低背景 蛋白需生物素化
蛋白连接强度高、特异和高密度，低背景 蛋白需His x6标记
表面蛋白分布均一容量
无需蛋白修饰过程，高结合容量
制作难，未商品化
蛋白质芯片的应用
疾病诊断和预警 药物开发 蛋白质组学
疾病诊断
定量检测组织提取液中的肿瘤标记物
孵育后的微阵列荧光图 A 含抗原 B 无抗原
uPA 尿激酶型纤溶酶原激活因子 PAI-1血浆纤溶酶原激活因子抑制因子 VEGT 血管内皮生长因子
微阵列方法与ELISA方法检出结果比较
药物开发
高通量筛选蛋白-蛋白作用抑制剂
His6-RB/GST-E7相互作用抑 制剂筛选微阵列图
蛋白质芯片的分类
➢ 蛋白质检测芯片 ➢ 蛋白质功能芯片
Methods for Protein Analysis
Gel electrophoresis, northern/western blot (fluorescence/radio active label) X-ray crystallography 2D - mass spectrometry Protein microarrays SELDI MS protein chips
加入His6-RB 加入含 PepC抑制剂的 His6-RB A 1500 个点阵的微阵列 B 局部点阵放大图及SPR信号 Jung SO, et al., Proteomics 2005, 5, 4427–4431.
蛋白质组学 人动脉平滑肌细胞蛋白谱
4.7% 抗原（一组细胞-细胞间相 互作用分子）表达上调； 13.4%抗原（结构蛋白，体液响 应蛋白）表达下降
Thank you ！
5.微阵列的封闭
主要封闭试剂：BSA或Gly
蛋白质芯片比较
表面
蛋白固定方式
优点
PVDF Nitrocellulose
吸附 吸附
无需蛋白修饰过程，高结合容量 无需蛋白修饰过程，高结合容量
缺点
非特异吸附，分布随机 非特异吸附，高背景，低密度
Poly-lysine coated 吸附，共
Aldehyde-coated 价偶联
细胞经oxidized low density lipoprotein作用后的蛋白谱
揭示了oxidized low density lipoprotein 诱导人动脉平滑肌细胞的作用模式
技术难点
成本过高, 需一系列昂贵的尖端仪器
芯片的标准化问题
提高芯片的特异性、简化样品制备和标记操 作程序、增加信号检测的灵敏度和消除芯片 背景对于结果分析的影响等等
的相互作用关系。
蛋白质芯片的关键技术1提出源自物学问题（实验目的）2
蛋白质芯片制备
6
数据分析和建模
（图象量化，标准化，
采集蛋白信息，建立模型）
检测
（荧光和比色扫描或拍照， 参数设置）
5
样品预处理
3
（重组蛋白，制备一、二级抗体，
荧光标记，配蛋白印记缓冲液）
生化反应
化学偶合，加底物， 反应温度和时间， 冲洗条件
Epoxy-activated
PDMS nanowell
共价
偶联
Gold coated silicon
无需蛋白修饰过程，高密度，
非特异吸附，分布随机
高分辨检测
高密度，高分辨检测
分布随机，表面有吸附
高密度，适合复杂的生化分析
高密度，低背景，易与SPR或MS 联用 分布随机，制作难，未商品化
Avidin coated Ni-NTA coated
4
蛋白质芯片的制备
1. 固相载体及其处理
载体（滴定板、滤膜、凝胶、载 玻片）
2. 蛋白质的预处理
选择具有较高纯度和完好生物活 性的蛋白进行溶解
3. 点制微阵列
可使用点制基因微阵列的商品化 点样仪或喷墨法等
4.固定微阵列上的蛋 白样点
膜为载体：芯片放入湿盒， 37°C 1h
载玻片为载体：化学修饰产生醛 基固定蛋白
展望—蛋白质芯片未来的发展重点
建立快速、廉价、高通量的蛋白质表达和纯化方法， 高通量制备抗体并定义每种抗体的亲和特异性。
改进基质材料的表面处理技术以减少蛋白质的非特异 性结合。
提高芯片制作的点阵速度；提供合适的温度和湿度以 保持芯片表面蛋白质的稳定性及生物活性。
研究通用的高灵敏度、高分辨率检测方法，实现成像 与数据分析一体化。
内容提要
➢蛋白质芯片概述 ➢蛋白质芯片的关键技术 ➢蛋白质芯片的应用 ➢展望
蛋白质的概述
蛋白质芯片，又称为蛋白质微阵列(protein micro array)是大 量的蛋白质分子(例如抗体或抗原分子)或肽链有序排列固定在 载体薄片上形成的。利用蛋白质或肽能特异性地与配体分子 (如抗体或抗原)结合的原理，芯片上的蛋白质分子或肽链与样 品中的相关成分发生反应，然后加入标记分子，并用阅读仪 分析和存储结果，这就是蛋白质芯片的工作原理。构建蛋白 质方阵需解决三个问题，一保持蛋白的活性，二保证蛋白质 正确定位，三与现存的基因微型方阵研究工具相兼容。蛋白 芯片是近年来蛋白质组学研究中兴起的一种新方法。它是在 基因芯片的基础上发展起来的。与传统的研究方法相比有以 下特点：(1)蛋白芯片是一种高通量的研究方法，能在一次实 验中提供大量的信息，使我们能够全而、准确地研究蛋白表 达谱；(2)灵敏度高，它可以检测出蛋白样品中微量蛋白的存 在，检测水平已达ng级；(3)所需的样品量极少。
蛋白质芯片的定义
生
基因芯片
蛋白质芯片, 又称蛋白质阵列
物
蛋白质芯片
或蛋白质微阵列，是指以蛋白质
芯
分子作为配基,将其有序地固定
片
微流控芯片
在固相载体的表面形成微阵列； 用标记了荧光的蛋白质或其他它
分子与之作用，洗去未结合的成
分，经荧光扫描等检测方式测定
芯片上各点的荧光强度，来分析
蛋白之间或蛋白与其它分子之间