蛋白质芯片技术
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His6-RB/GST-E7相互作用抑 制剂筛选微阵列图
加入His6-RB 加入含 PepC抑制剂的 His6-RB A 1500 个点阵的微阵列
B 局部点阵放大图及SPR信号
Jung SO, et al., Proteomics 2005, 5, 4427–4431.
蛋白质组学
人动脉平滑肌细胞蛋白谱
吸附，共
价偶联
无需蛋白修饰过程，高密度， 高分辨检测 高密度，高分辨检测
非特异吸附，分布随机
Aldehyde-coated Epoxy-activated
PDMS nanowell Gold coated silicon
分布随机，表面有吸附
共价 偶联
高密度，适合复杂的生化分析 高密度，低背景，易与SPR或MS 联用 分布随机，制作难，未商品化
[9] Jung SO, et al., Proteomics 2005, 5, 4427–4431.
[10] Schena M, Protein microarrays,2005, 7.
蛋白质芯片检测信号的提高
优化芯片制作过程各种参数；
使用金粒子作为辅助标记分子；
添加SiO2和TiO2层提高表面反 射 Au-labelled anti-rabbit IgG放大照片
Markus F, et al., DDT, 2002, 7,815-822.
微流控芯片
www.proteinmicroarrays.com/
Bertone P,et al., FEBS Journal, 2005, 272 , 5400–5411.
研究蛋白质芯片的意义
蛋白质是基因表达的最终产物, 接近生命活动的物 质层面；
孵育后的微阵列荧光图 A 含抗原 B 无抗原
uPA 尿激酶型纤溶酶原激活因子 PAI-1血浆纤溶酶原激活因子抑制因子
VEGT 血管内皮生长因子
微阵列方法与ELISA方法检出结果比较 Weissenstein U, Proteomics 2006, 6, 1427–1436.
药物开发
高通量筛选蛋白-蛋白作用抑制剂
• The Protein Microarray System is a complete microarray platform that includes microarray manufacturing, processing, surface chemistry, detection and analysis.
5.微阵列的封闭
主要封闭试剂：BSA或Gly
李瑶，基因芯片与功能基因组，2004，32-33.
蛋白质芯片比较
表面
PVDF Nitrocellulose
蛋白固定方式
吸附 吸附
优点
无需蛋白修饰过程，高结合容量 无需蛋白修饰过程，高结合容量
缺点
非特异吸附，分布随机 非特异吸附，高背景，低密度
Poly-lysine coated
Avidin coated Ni-NTA coated
亲和结合 亲和结合
蛋白连接强度高、特异和高密度，低背景 蛋白连接强度高、特异和高密度，低背景 表面蛋白分布均一容量
蛋白需生物素化 蛋白需His x6标记
Agarose thin film 3D gel pad 扩散 无需蛋白修饰过程，高结合容量
制作难，未商品化
4
蛋白质芯片的制备
1. 固相载体及其处理
载体（滴定板、滤膜、凝胶、载 玻片）
4.固定微阵列上的蛋 白样点
膜为载体：芯片放入湿盒， 37°C 1h 载玻片为载体：化学修饰产生醛 基固定蛋白
2. 蛋白质的预处理
选择具有较高纯度和完好生物活 性的蛋白进行溶解
3. 点制微阵列
可使用点制基因微阵列的商品化 点样仪或喷墨法等
4.7% 抗原（一组细胞-细胞间相 互作用分子）表达上调； 13.4%抗原（结构蛋白，体液响 应蛋白）表达下降
细胞经oxidized low density lipoprotein作用后的蛋白谱 揭示了oxidized low density lipoprotein 诱导人动脉平滑肌细胞的作用模式 Sukhanov S and Delafontaine P，Proteomics, 2005, 5, 1274–1280.
探针蛋白特异性高、亲和力强, 可简化样品前处理， 甚至可直接利用生物材料(血样、尿样、细胞及组 织等)进行检测； 适合高通量筛选与靶蛋白作用的化合物；
有助于了解药物或毒物与其效应相关蛋白质的相 互作用。
蛋白质芯片的分类
蛋白质检测芯片
蛋白质功能芯片
Poetz O et. al, Mechanisms of geing and Development, 2005, 126 ,161–170.
Seminar I
蛋白质芯片研究进展
内容提要
蛋白质芯片概述
蛋白质芯片的关键技术 蛋白质芯片的应用 展望
蛋白质芯片的定义
生 物 芯 片
基因芯片
蛋白质芯片, 又称蛋白质阵列
蛋白质芯片
或蛋白质微阵列，是指以蛋白质
分子作为配基,将其有序地固定
在固相载体的表面形成微阵列； 用标记了荧光的蛋白质或其他它 分子与之作用，洗去未结合的成 分，经荧光扫描等检测方式测定 芯片上各点的荧光强度，来分析 蛋白之间或蛋白与其它分子之间 的相互作用关系。
存在的问题
成本过高, 需一系列昂贵的尖端仪器
芯片的标准化问题 提高芯片的特异性、简化样品制备和标记 操作程序、增加信号检测的灵敏度和消除 芯片背景对于结果分析的影响等等
展望—蛋白质芯片未来的发展重点
建立快速、廉价、高通量的蛋白质表达和纯化方法， 高通量制备抗体并定义每种抗体的亲和特异性。
It is suitable for a variety of proteomic applications including Micro Multianalyte Immunoassays, protein-antibody, antibody-protein, antibody-antigen, protein-protein, and protein-drug microarray assays.
Zhu H et.al, Current Opinion in chemical Biology,2003,7,55-63.
蛋白质芯片检测
探针标记检测法
同位素标记检测 荧光标记检测
无探针标记检测法
表面增强激光解吸离子化技术
(Surface enhanced laser desorption/ionization, SELDI)
化学发光检测
酶免疫标记检测 胶体金标记检测
表面等离子体共振检测技术
（surface plasmon resonance, SPR）
原子力显微镜检测技术
（atomic force microscope, AFM ）
蛋白质芯片的应用
疾病诊断和预警
药物开发
蛋白质组学
Hale Waihona Puke Baidu
疾病诊断
定量检测组织提取液中的肿瘤标记物
蛋白质芯片的关键技术
1
提出生物学问题
（实验目的）
2
蛋白质芯片制备
6
数据分析和建模
（图象量化，标准化，
采集蛋白信息，建立模型）
样品预处理
（重组蛋白，制备一、二级抗体，
荧光标记，配蛋白印记缓冲液）
3
检测
（荧光和比色扫描或拍照， 参数设置）
生化反应
化学偶合，加底物， 反应温度和时间， 冲洗条件
5
Schena M, Protein microarrays,2005, 7.
改进基质材料的表面处理技术以减少蛋白质的非特异 性结合。 提高芯片制作的点阵速度；提供合适的温度和湿度以 保持芯片表面蛋白质的稳定性及生物活性。 研究通用的高灵敏度、高分辨率检测方法，实现成像 与数据分析一体化。
参考文献
[1] Markus F, et al., DDT, 2002, 7,815-822. [2] Bertone P,et al., FEBS Journal, 2005, 272 , 5400–5411. [3] Poetz O et. al, Mechanisms of geing and Development, 2005, 126 ,161– 170. [4] 李瑶，基因芯片与功能基因组，2004，32-33 [5] Zhu H et.al, Current Opinion in chemical Biology, 2003,755-63. [6] Weissenstein U, Proteomics 2006, 6, 1427–1436. [7] Fang Y，et al., ChemBioChem 2002, 3, 987- 991. [8] Sukhanov S and Delafontaine P，Proteomics, 2005, 5, 1274–1280.
Au 的尺寸及其与Dy633的比例 对 信号的影响 5 nm Au-particle 10 nm Au-particle.
Sauera U，et al., Sensors and Actuators B, 2005, 107, 178–183.
Protein Microarray System
TeleChem / arrayit.com http://arrayit.com
药物开发
G-蛋白偶联受体芯片
肾上腺素受体 芯片（含三个 亚型）筛选抑 制剂
抑制剂
Fang Y，et al., ChemBioChem 2002, 3, 987- 991.
• SELDI把基质改为
www.evms.edu/vpc/ seldi/seldiprocess/
加入His6-RB 加入含 PepC抑制剂的 His6-RB A 1500 个点阵的微阵列
B 局部点阵放大图及SPR信号
Jung SO, et al., Proteomics 2005, 5, 4427–4431.
蛋白质组学
人动脉平滑肌细胞蛋白谱
吸附，共
价偶联
无需蛋白修饰过程，高密度， 高分辨检测 高密度，高分辨检测
非特异吸附，分布随机
Aldehyde-coated Epoxy-activated
PDMS nanowell Gold coated silicon
分布随机，表面有吸附
共价 偶联
高密度，适合复杂的生化分析 高密度，低背景，易与SPR或MS 联用 分布随机，制作难，未商品化
[9] Jung SO, et al., Proteomics 2005, 5, 4427–4431.
[10] Schena M, Protein microarrays,2005, 7.
蛋白质芯片检测信号的提高
优化芯片制作过程各种参数；
使用金粒子作为辅助标记分子；
添加SiO2和TiO2层提高表面反 射 Au-labelled anti-rabbit IgG放大照片
Markus F, et al., DDT, 2002, 7,815-822.
微流控芯片
www.proteinmicroarrays.com/
Bertone P,et al., FEBS Journal, 2005, 272 , 5400–5411.
研究蛋白质芯片的意义
蛋白质是基因表达的最终产物, 接近生命活动的物 质层面；
孵育后的微阵列荧光图 A 含抗原 B 无抗原
uPA 尿激酶型纤溶酶原激活因子 PAI-1血浆纤溶酶原激活因子抑制因子
VEGT 血管内皮生长因子
微阵列方法与ELISA方法检出结果比较 Weissenstein U, Proteomics 2006, 6, 1427–1436.
药物开发
高通量筛选蛋白-蛋白作用抑制剂
• The Protein Microarray System is a complete microarray platform that includes microarray manufacturing, processing, surface chemistry, detection and analysis.
5.微阵列的封闭
主要封闭试剂：BSA或Gly
李瑶，基因芯片与功能基因组，2004，32-33.
蛋白质芯片比较
表面
PVDF Nitrocellulose
蛋白固定方式
吸附 吸附
优点
无需蛋白修饰过程，高结合容量 无需蛋白修饰过程，高结合容量
缺点
非特异吸附，分布随机 非特异吸附，高背景，低密度
Poly-lysine coated
Avidin coated Ni-NTA coated
亲和结合 亲和结合
蛋白连接强度高、特异和高密度，低背景 蛋白连接强度高、特异和高密度，低背景 表面蛋白分布均一容量
蛋白需生物素化 蛋白需His x6标记
Agarose thin film 3D gel pad 扩散 无需蛋白修饰过程，高结合容量
制作难，未商品化
4
蛋白质芯片的制备
1. 固相载体及其处理
载体（滴定板、滤膜、凝胶、载 玻片）
4.固定微阵列上的蛋 白样点
膜为载体：芯片放入湿盒， 37°C 1h 载玻片为载体：化学修饰产生醛 基固定蛋白
2. 蛋白质的预处理
选择具有较高纯度和完好生物活 性的蛋白进行溶解
3. 点制微阵列
可使用点制基因微阵列的商品化 点样仪或喷墨法等
4.7% 抗原（一组细胞-细胞间相 互作用分子）表达上调； 13.4%抗原（结构蛋白，体液响 应蛋白）表达下降
细胞经oxidized low density lipoprotein作用后的蛋白谱 揭示了oxidized low density lipoprotein 诱导人动脉平滑肌细胞的作用模式 Sukhanov S and Delafontaine P，Proteomics, 2005, 5, 1274–1280.
探针蛋白特异性高、亲和力强, 可简化样品前处理， 甚至可直接利用生物材料(血样、尿样、细胞及组 织等)进行检测； 适合高通量筛选与靶蛋白作用的化合物；
有助于了解药物或毒物与其效应相关蛋白质的相 互作用。
蛋白质芯片的分类
蛋白质检测芯片
蛋白质功能芯片
Poetz O et. al, Mechanisms of geing and Development, 2005, 126 ,161–170.
Seminar I
蛋白质芯片研究进展
内容提要
蛋白质芯片概述
蛋白质芯片的关键技术 蛋白质芯片的应用 展望
蛋白质芯片的定义
生 物 芯 片
基因芯片
蛋白质芯片, 又称蛋白质阵列
蛋白质芯片
或蛋白质微阵列，是指以蛋白质
分子作为配基,将其有序地固定
在固相载体的表面形成微阵列； 用标记了荧光的蛋白质或其他它 分子与之作用，洗去未结合的成 分，经荧光扫描等检测方式测定 芯片上各点的荧光强度，来分析 蛋白之间或蛋白与其它分子之间 的相互作用关系。
存在的问题
成本过高, 需一系列昂贵的尖端仪器
芯片的标准化问题 提高芯片的特异性、简化样品制备和标记 操作程序、增加信号检测的灵敏度和消除 芯片背景对于结果分析的影响等等
展望—蛋白质芯片未来的发展重点
建立快速、廉价、高通量的蛋白质表达和纯化方法， 高通量制备抗体并定义每种抗体的亲和特异性。
It is suitable for a variety of proteomic applications including Micro Multianalyte Immunoassays, protein-antibody, antibody-protein, antibody-antigen, protein-protein, and protein-drug microarray assays.
Zhu H et.al, Current Opinion in chemical Biology,2003,7,55-63.
蛋白质芯片检测
探针标记检测法
同位素标记检测 荧光标记检测
无探针标记检测法
表面增强激光解吸离子化技术
(Surface enhanced laser desorption/ionization, SELDI)
化学发光检测
酶免疫标记检测 胶体金标记检测
表面等离子体共振检测技术
（surface plasmon resonance, SPR）
原子力显微镜检测技术
（atomic force microscope, AFM ）
蛋白质芯片的应用
疾病诊断和预警
药物开发
蛋白质组学
Hale Waihona Puke Baidu
疾病诊断
定量检测组织提取液中的肿瘤标记物
蛋白质芯片的关键技术
1
提出生物学问题
（实验目的）
2
蛋白质芯片制备
6
数据分析和建模
（图象量化，标准化，
采集蛋白信息，建立模型）
样品预处理
（重组蛋白，制备一、二级抗体，
荧光标记，配蛋白印记缓冲液）
3
检测
（荧光和比色扫描或拍照， 参数设置）
生化反应
化学偶合，加底物， 反应温度和时间， 冲洗条件
5
Schena M, Protein microarrays,2005, 7.
改进基质材料的表面处理技术以减少蛋白质的非特异 性结合。 提高芯片制作的点阵速度；提供合适的温度和湿度以 保持芯片表面蛋白质的稳定性及生物活性。 研究通用的高灵敏度、高分辨率检测方法，实现成像 与数据分析一体化。
参考文献
[1] Markus F, et al., DDT, 2002, 7,815-822. [2] Bertone P,et al., FEBS Journal, 2005, 272 , 5400–5411. [3] Poetz O et. al, Mechanisms of geing and Development, 2005, 126 ,161– 170. [4] 李瑶，基因芯片与功能基因组，2004，32-33 [5] Zhu H et.al, Current Opinion in chemical Biology, 2003,755-63. [6] Weissenstein U, Proteomics 2006, 6, 1427–1436. [7] Fang Y，et al., ChemBioChem 2002, 3, 987- 991. [8] Sukhanov S and Delafontaine P，Proteomics, 2005, 5, 1274–1280.
Au 的尺寸及其与Dy633的比例 对 信号的影响 5 nm Au-particle 10 nm Au-particle.
Sauera U，et al., Sensors and Actuators B, 2005, 107, 178–183.
Protein Microarray System
TeleChem / arrayit.com http://arrayit.com
药物开发
G-蛋白偶联受体芯片
肾上腺素受体 芯片（含三个 亚型）筛选抑 制剂
抑制剂
Fang Y，et al., ChemBioChem 2002, 3, 987- 991.
• SELDI把基质改为
www.evms.edu/vpc/ seldi/seldiprocess/