蛋白质银染原理与方法

原理：蛋白质条带的银染是基于蛋白质中各种基团（如琉基、碳基等）与银的结合，检测极限是2～5.0ng／蛋白条带。

① SDS-PAGE电泳。

注意：银染检测蛋白质的水平是在100ng左右，与Commassie
Blue染色比较，银染加样量要少。

否则难以得到清晰的电泳分辨率。

②电泳结束后，戴手套将PAGE胶转移到干净的玻璃培养皿或TIP头盒盖中。

加入25ml Fixing
Solution（固定液），室温振荡保温30min。

胶需要完全淹没在固定液中。

③彻底弃去固定液，加入25ml
Incubation Solution（保育液），室温振荡保温30min。

胶需要完全淹没在保育液中。

④彻底弃去Incubation
Solution（保育液），用50ml去离子水洗3次，每次5min。

⑤准备：取2.5ml 10X
Silvering Solution, 加入22.5mL水，混匀后使用。

⑥弃去洗涤的水，加入25ml
Silvering Solution (银染液)。

室温振荡保温20min。

⑦彻底弃去银染液，加入25mL
Developing
Solution（显色液），室温振荡保温1~10min。

注意观察目的条带。

如果目的条带出现了，可以考虑终止显色。

显色时间不要过长，否则本底较深。

⑧彻底弃去显色液,
加入25mLStopping Solution（终止液），室温振荡保温10min。

⑨彻底弃去Stopping
Solution（终止液），用50mL去离子水洗3次，每次5min。

弃去洗涤的水，加入25mL Preserving
Solution（保护液），室温振荡保温20min。

银染PAGE胶可以拍照保存，也可以室温玻璃纸干燥。

今天第一次银染，结果出来啥也没有，凝胶就像一块海带一样。

能不能提供详细的银染步骤呢？好像有好几种版本，哪位大侠有经验的希望能点拨一下？
hotstoe wrote:
1. 取下凝胶,蒸馏水冼胶30秒.
2. 0.1% 硝酸银染色10分钟.
3. 弃去染色液,蒸馏水洗胶1分钟.
4.显色液显色15秒,换用新的显色液,显清条带为止.
显色液配方: 10克氢氧化钠+0.2克碳酸钠+2m甲醛溶液,定溶到500ml.
这个染色方法挺好的,我用过.注意染色时间不能长.
我的经验是：1.取下凝胶用去离子水冼胶30秒三次，
2.0.1% 硝酸银染色10分钟.
3.弃去染色液,蒸馏水洗胶1分钟（换2次去离子水）
4.显色液显色15秒,换用新的显色液,显清条带为止.不要试图将所有的条带都显出来，要求越
高可能导致背景就深，
5.染色后要用固定液（冰乙酸）终止染色，
6.固定3分钟后再用去离子水洗涤2遍（整个试验比较费去离子水）。

多谢各位的指导!
我现在是在12%的凝胶里加入丙三醇优化.
现在的问题是背景和条带都很浅.仍能分辨读出条带数,但是拍摄出来的还是不清楚.
请问有必要提高硝酸银的浓度吗?(我现在用的是0.15%的硝酸银)
向各位请教几个关于TRAP-银染的问题，多谢各位指教。

我用的是鼎国的试剂盒做的TRAP，用的是8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后是银染，但是结果很令人失望，电泳的胶取下来的时候竟然破成了好几片，染色后也看不出什么结果，我想问的是TRAP-银染，这个实验成功的关键步骤在哪里，哪一步最容易出问题？银染后理想的结果应该是什么样子的？请说的具体点好吗，谢谢。

背景是什么样的比较好，还有条带应该是什么颜色，有多深，什么样的。

谢谢了！
我的做法是这样的，染色效果还可以
10%的乙醇固定10分钟，ddH2O洗一次，2分钟。

1%的硝酸脱色4分钟，ddH2O洗两次，每次1分钟。

0.2%AgNO3染色20分钟，ddH2O洗三次，每次1分钟。

NaCO3-甲醛显色至条带出现。

我的感觉是乙醇和硝酸重复使用的次数不要太多，这样效果不好，NaCO3-甲醛得质量很关键，我们有一次换了试剂，效果非常差。

1) 10%乙醇，5 min；
2)双蒸水过水2次（短暂）；
3)1%硝酸，5min；
4)双蒸水过水；
5)0.2%硝酸银，在摇床摇动10 min；
6)双蒸水过水（不超过5sec）；
7)显影液显影，边晃动边显影，至显影满意为止；
8)10%冰乙酸固定，至无气泡；
9)40℃烘箱，3天；
10)剥离，保存。

Notes:显影液的配制：
无水碳酸钠3.09g
甲醛100ul
硫代硫酸钠（1%）10ul
双蒸水100ml
银染法分以下几个程序：
1、固定
2、敏化
3、银育
4、显影
5、停显
此外，其间还有数步的漂洗程序。

在你的银染方法中没有敏化过程，不过也中可以的，只是灵敏度会下降。

银染法还可分为碱性银染和酸性银染法，你的方法为酸性银染法。

为何称为酸法？是指硝酸银这一强酸弱碱盐溶液因水解呈酸性而得名？
何为二胺类银染法？俺知道有银铵法，即在硝酸银溶液中加入氢氧化钠，银离子在氢氧化钠的作用下生成氢氧化银沉淀，后加入过量氨水，形成可溶的银铵络和物，而后者经甲醛还原为单质银颗粒。

二胺法可是指此络和物为二铵盐？您这里的“胺”应为“铵”。

至于敏化作用，众说纷纭，且银染的灵敏度相当高，对常规分子生物学实验已是牛刀小用，敏化俺认为还是不用的好，因为对背景不利。

对于银染的研究在80年代的electrophoresis杂志中多有报道。

小经验：为便于控制显影速度，得到最佳的信噪比，银染的显影液温度不要过高，以10度左右为宜，高则易显影过度，背景深，低则显影时间长。

考染后银染我做过不少次，银染的效果还是不错的。

无需把考染的蛋白条带全部脱色，只要本底脱差不多就可以了。

银染的固定步骤也可以省略，因为在考染前已经固定过了。

只需要用6.25％乙酸钠+0.125%戊二醛＋30％乙醇＋0.25％硫代硫酸钠浸泡30min，去离子水清洗3次，每次5min，0.1％硝酸银染色20min，去离子水清洗膜两面，就可以用碳酸钠＋甲醛的显色液显色了，直到自己满意为止，再用5％乙酸终止显色。

效果还是很好的。

1,--原理：蛋白质条带的银染是基于蛋白质中各种基团（如琉基、碳基等）与银的结合，检测极限是2～5.0ng／蛋白条带。

2，材料及注意；
固定和脱色液
10％（／）戊二醛（用50％贮液现用现配，Kodak）
硝酸银溶液（含氨）
洗印显影液
Kodak快速定影液A
【注】全过程需穿戴手套，以免指纹污染。

3，步骤：
步骤：
l）将聚丙烯酰胺凝胶放在塑料容器并以5倍体积的固定液覆盖，在旋转摇床中缓慢摇
动30min以上。

2）倾去固定液，加5倍凝胶体积的脱色液，缓慢摇动60 min以上。

3）倾去脱色液，加5倍凝胶体积的10％戊二醛，在道凤橱中缓慢摇动30min。

小心:带手套并仅在通风泅中进行。

4)倾去戊二醛溶液，用水洗凝胶4次以上，每次30 min以上，最后一次洗涤以过夜为
佳。

缓慢摇动。

5）倾去水，将凝胶置于约5倍凝胶体积的硝酸银榕液中平衡（完全盖没凝胶），剧烈振荡15 mln。

小心：由于氨银溶液干燥会发主爆炸．应马上用大量水冲洗
6）将凝胶移至另一塑料盒，用去离子水洗5次。

每次精确5min，缓慢摇动。

7）用500mL水稀释25mL显影液，将凝胶移至另一塑料盒，加人足够的稀释显影液盖
没凝胶，并剧烈摇动至条带达到需要的强度。

如果显影液变成傣色。

须换新鲜的显影
液。

8）换Kodak快速定影液，定影5 mln，必要时，用湿润了的棉花搽去凝胶表面沉积的残
余银沉积物。

倾去定影液，用水彻底冲洗凝胶（4～5 min）。

9）凝胶拍照
这是我经常用的步骤，经过检验n次了，希望能帮助你。

蛋白银染步骤
步骤溶液时间
固定甲醇100ml
冰醋酸25ml
加双蒸水至250ml 30min
冲洗双蒸水3次
敏化甲醇75ml
戊二醛（25%w/） 1.25ml
硫代硫酸钠(5%w/) 10ml
醋酸钠（17g）
加双蒸水至250ml 30min
冲洗双蒸水3次
银反应硝酸银溶液(2.5%w/) 25ml
甲醛(37%w/) 0.1ml
加双蒸水至250ml 20min
冲洗双蒸水2次
显色碳酸钠(6.25g)
甲醛(37%w/) 0.05ml
加双蒸水至250ml
2-5min
终止EDTA-Na22H2O(3.65g)
加双蒸水至250ml 10min
冲洗双蒸水3次
我室固定的蛋白银染方法，效果很不错，也很简单，步骤如下：
1）PAGE胶切下后用50％乙醇（100ml左右）洗三次，每次20分钟
2）2％硫代乙醇酸钠稀释50倍作用1分钟，双蒸水洗3次，每次20秒
3）2％硝酸银稀释10倍作用20分钟，双蒸水洗3次，每次20秒
4）6％碳酸钠溶液显色，直到条带清晰为止，一般几分钟，大量水冲洗
5）加中止液10％乙酸中止即可
silia wrote:
我室固定的蛋白银染方法，效果很不错，也很简单，步骤如下：
1）PAGE胶切下后用50％乙醇（100ml左右）洗三次，每次20分钟
2）2％硫代乙醇酸钠稀释50倍作用1分钟，双蒸水洗3次，每次20秒
3）2％硝酸银稀释10倍作用20分钟，双蒸水洗3次，每次20秒
4）6％碳酸钠溶液显色，直到条带清晰为止，一般几分钟，大量水冲洗
5）加中止液10％乙酸中止即可
大家好，我看了此贴，有一点不太明白，
硫代乙醇酸钠，是什么药品，是不是作者写错啦？望大虾指点。

急，盼复。

另外，其后的洗20秒还是20分呀？
我推荐使用graymatter 的protocol,基本上和我们用的一致，应该很稳定的，其中稍稍有一些经验,如:
1. 固定这步是可以过夜的。

2. 加银染液后一定要避光！！
3. 在固定、银染这几步最好放在摇动托盘上！这样随着的液体的晃动作用比较均匀。

4. 显色这步很关键，需要一些摸索，新手经常会显过了，整个gel黑糊糊的！
5. 显色对光线没有太大要求，室内可见光就行。

6. 接触gel时有条件一定要带一次性手套，要不然可以染出来一个大手印的！
前面几位说的很好，而且看来非常富有经验
不过，咱也贡献一把吧，只是一点注意事项：
1，最好全部用去离子水，电阻>=18兆欧
2，如果想要充分显色，可以适当提高温度，比如37度温箱
3，最好戴手套处理全过程
ptotocol是这样的，请看哪里不妥：
蛋白银染步骤
步骤溶液时间
固定甲醇100ml
冰醋酸25ml
加双蒸水至250ml 30min
冲洗双蒸水3次
敏化甲醇75ml
戊二醛（25%w/） 1.25ml
硫代硫酸钠(5%w/) 10ml
醋酸钠（17g）
加双蒸水至250ml 30min
冲洗双蒸水3次
银反应硝酸银溶液(2.5%w/) 25ml
甲醛(37%w/) 0.1ml
加双蒸水至250ml 20min
冲洗双蒸水2次
显色碳酸钠(6.25g)
甲醛(37%w/) 0.05ml
加双蒸水至250ml
2-5min
终止EDTA-Na22H2O(3.65g)
加双蒸水至250ml 10min
冲洗双蒸水3次
建议使用silia的方法！！
简单，快！
本人的银染方法：
1. 固定：100ml MeOH, 24ml H Ac, 56ml 0.04%HCHO, 20ml ddH2O,洗三次，每次>=20分钟；
2. 50％EtOH洗PAGE胶三次，每次20分钟；
3. 预处理：0.02％Na2S2O3 处理一分钟；
4. 水洗：ddH2O漂洗三次，每次20秒；
5. 染色：0.8ml 20％AgNO3+72ml 0.04%HCHO处理PAGE胶20分钟；
6. 水洗：同上；
7. 显色：25ml 12％Na2CO3, 24ml 0.04%HCHO, 1ml 0.02％Na2S2O3, 漂洗10－15分钟；
8. 水洗：同上；
9. 终止：50％MeOH, 12％H Ac,10分钟。

以上步骤从中科院生化所学来，过程和silia 的基本一致，不知道是否有出入，请大家指正。

谢谢！！！
5.2.2.3 银染色
1 银染液1（1000ml）：甲醇50％乙酸12％
甲醇500ml 冰醋酸120ml
2 银染液2（1000ml）：甲醇30％，乙酸钠0.4M，戊二醛0.5%，硫代硫酸钠0.1%，（含乙酸1－2ml）
甲醇300ml 乙酸钠54.4g 戊二醛10ml 硫代硫酸钠1g 乙酸1－2ml
3 显色液(1000ml) 无水碳酸钠2.5% 甲醛0.02%
无水碳酸钠25g，甲醛1.5ml
4 硝酸银（100ml）：20%硝酸银（过滤后待用）
染色步骤：
1 银染液1 洗2次，每次5分钟
2 银染液2 洗1次，每次30分钟
3 超纯水洗2次，每次1分钟
4 0.5%硝酸银洗30分钟
5 超纯水洗5次，每次1分钟（关键步骤，共计5分钟）显色液显色
6 看到各条带，则倾去显色液, 1％乙酸中止
我感觉浸银后、显色前的水洗非常关键，时间不能太长，次数不能太多，否则可能会染不上颜色。

但水洗不充分又可能导致背景较深。

我个人一般是用水洗三遍，每次半分钟左右。

固定液：50%乙醇，10%冰醋酸，40%水
浸泡液：30%乙醇，6.8% NaAc，50%戊二醛0.625ml，0.2% NaS2O3•5H2O
银染液：0.1% AgNO3，0.02% 甲醛
显色液：2.5% Na2CO3，0.01% 甲醛
终止液：1.46% EDTA-2Na•2H2O
银染方法：参照phamacia 公司提供的银染方法。

凝胶－固定液30分钟－浸泡液30分中－水洗5分钟，2次－－银染液20分钟－－－显色液2-10分钟－－终止液10分钟。

完毕！
像海带是什么意思，都染黑了吗，首选确定是不是有蛋白，如果这个没问题那就是染色时间过长了，注意银染几分钟条带就出来了，一定要看着它着色，一旦觉得是最佳效果，要立刻换终止液终止反应
上面是我以前查的别人以及自己的经验，你可以参照着总结一下，大致步骤都差不多的
谢谢DF1。

蛋白现在还不能确定有没有。

但是MARKER也没有看到。

染色时间可能是太长了。

我再试试。