北大医学部常青 率先发现髓母细胞瘤分子标志物Mir-449a 有助于获得精确诊断和精准治疗机会

⏹北大医学部常青: 率先发现髓母细胞瘤分子标志物Mir-449a 有助于获得精确诊断和
精准治疗机会
⏹ 2017-02-15
⏹神外前沿讯，高度恶性的髓母细胞瘤是很多患儿家长的噩梦，但髓母细胞瘤并非千
人一面，通过最新的分子病理检测技术，可以诊断出与预后和治疗相关的4个不同的分子亚型，帮助神经外科医生实现更为精确的诊断和更为有效的治疗。

⏹髓母细胞瘤主要发生于14岁以下的儿童，是儿童中最常见的恶性脑肿瘤。

目前认为，
MB根据基因表达谱差异可以分为至少4个分子亚型，包括WNT亚型，SHH亚型，Group3和Group4。

在这4种分子亚型中，WNT组预后相对最好，Group3预后相对最差。

⏹北京大学医学部病理学系（暨北京大学第三医院病理科）常青副教授长期专注于髓
母细胞瘤的分子病理科研与临床前沿，最近应用髓母细胞瘤分子诊断金标准NanoString平台，在国际上率先发现与WNT亚型髓母相关的分子标志物Mir-449，从而更为准确地对髓母细胞瘤进行分子病理诊断和分子分型，并正在进一步探索与其相关的基因靶点。

⏹以下是《神外前沿》与常青教授对话实录：
⏹神外前沿：现在您做的是分子病理还是传统上的病理？
⏹常青：现阶段的病理医生已经不能把分子病理和传统意义上的基于组织形态学的病
理截然分开了，病理已经发展到分子病理的时代。

基于最新2016版WHO神经肿瘤分类提出的要求，神经肿瘤病理医生现在发给临床医生的应该是基于组织学分型，WHO分级，分子检测结果等全部信息整合后的病理诊断报告，其中的分子检测信息也是指导外科医生针对患者实施干预的分子基础。

⏹分子病理可以对脑肿瘤的原有形态学诊断进行重新分类和分组，使病理诊断更为精
确，从而达到指导精准治疗、协助判断预后以及预测部分药物治疗疗效的目的。

比如一部分过去基于组织形态学诊断的弥漫性星形细胞瘤，经过分子检测，发现不具有弥漫性星形细胞瘤所特有的分子改变，如ATRX缺失和p53突变等，而是具有少突胶质细胞瘤的分子改变特点，如1p19q的共缺失。

这种情况，肿瘤应当诊断为少突胶质细胞瘤，而不是弥漫性星形细胞瘤。

⏹神外前沿：分子病理如何开展的？
⏹常青：我们北京大学医学部病理系基本已经具备了与国际接轨的的脑肿瘤分子病理
检测平台。

⏹神外前沿：您指的平台是什么技术平台？
常青：在脑肿瘤分子检测技术平台方面，除了目前国内已普遍开展的常规检测项目，包括免疫组化（IDH1突变，ATRX缺失及p53突变检测等）、DNA检测技术（IDH1及BRAF突变等）和FISH荧光原位杂交技术（1p19q 共缺失及MYC基因扩增）等，我们还在国内率先建立了基于NanoString分子检测平台的髓母细胞瘤分子分型技术，这是基于RNA表达水平的分子检测平台，是目前国际公认的可用于髓母细胞瘤分子亚型检测的平台，基于该平台，我们采用了包含22个髓母分子亚型特异性基因的分子套餐对45例髓母细胞瘤进行了分子亚型检测，有效率达95%以上，这一分子检测平台比免疫组化套餐方法更精确，被认为是对髓母进行分子分型的金标准，我们在这方面的工作目前和国际上对髓母细胞瘤分子亚型的检测是完全接轨的，相关文章已发表（Journal of Neuro-Oncology, 杂志《Mir-449a, a potential diagnostic biomarker for subtyping of medulloblastoma》2016，详见《神外前沿》其它报道）
⏹神外前沿：这个平台目前只有你们有？
常青：据我所知，对于髓母的分子亚型检测平台，目前我们在国内应该是领先的。

⏹神外前沿：除了髓母，还在哪个领域的分子病理研究比较多？
⏹常青：我们课题组对于中国成人星形细胞肿瘤患者，做过相关分子检测与预后关系
的研究，相关研究发表在Histology and Histopathology 杂志上了。

（《ATRX loss in adult supratentorial diffuse astrocytomas correlates with p53 over expression and IDH1 mutation and predicts better outcome in p53 accumulated patients 》2016，详见《神外前沿》其它报道）
⏹研究内容涉及到之前提到的几个国际公认的指标，包括IDH1R132H及p53的突变，
ATRX的缺失，1p19q共缺失以及MGMT启动子的甲基化等分子改变检测。

我们的研究首次提出成人星形细胞肿瘤中ATRX缺失和p53突变之间具有关联性，并与患者的预后相关，我们发现具有p53突变的成人星形细胞肿瘤中伴有ATRX缺失的预后相对于不伴ATRX缺失的预后好。

⏹神外前沿：您什么时候开始接触到分子病理？
⏹常青：近几年随着一些新的脑肿瘤分子标志物的出现，尤其是2011年前后国际前沿
杂志发表的相关文章不断涌现，我们就开始关注分子病理在中国脑肿瘤人群的常规临床病理诊断中的作用。

⏹神外前沿：为什么专注于神经肿瘤？
⏹常青：一个患有髓母细胞瘤的孩子，他的家长最关心的问题是，孩子的肿瘤是偏好
的类型还是偏坏的类型，如果是偏坏的类型，希望经过治疗能尽量延长他的生命，如果是偏好的类型，希望治疗手段尽量轻微，以减少对孩子脑功能和智力的伤害。

这也是对髓母进行精确分子分型的最朴素的诉求。

我从博士课题阶段就一直研究髓母细胞瘤，个人也比较感兴趣。

另外，关于髓母细胞瘤亚型的研究日新月异，有很大的科研价值和社会价值。

⏹神外前沿：研究髓母细胞瘤的话，北医及北医三院的病理标本量大吗？
⏹常青：目前国内脑肿瘤患者相对集中在几家以神经外科见长的医院就诊，我们本院
的脑肿瘤病例数并不是很多，但我们的合作单位包括了国内多家大医院的脑肿瘤标本。

国外对脑肿瘤分子病理的研究，目前也有多中心联合的趋势。

我们的目标是发挥我们在分子检测技术方面的优势，积极促进国内病理界在脑肿瘤分子病理诊断方面与国际接轨。

⏹神外前沿：髓母细胞瘤分子检测已经进入临床阶段了吗？
⏹常青：目前我们关于髓母细胞瘤分子检测的科研成果已正式发表，方法也已成熟，
部分检测项目已经应用于临床，如FISH方法对MYC扩增进行检测，这是髓母细胞瘤预后较差的分子指标。

下一步将把Nanostring 的分子检测平台对髓母的分子分型推向临床应用。

今年北京大学医学部病理系申请到了北京市神经系统疾病重点实验室，这将对我们的工作起积极推动作用。

⏹神外前沿：与独立的第三方分子病理检测机构相比，你们在检测上有什么不同？
常青：相对于目前第三方比较普遍应用的二代检测技术，我们的检测手段更具有针对性，尽量“缩小包围圈”，最大限度上节省从超大信息量中提取与患者相关的有价值信息的时间成本和技术成本。

⏹神外前沿：您分子病理研究的重点主要在髓母细胞瘤，有什么新的发现吗
⏹常青：我们前期的研究主要集中在微小RNA上，这是一种小片段基因序列，相对稳
定，不易降解，对开展分子检测的材料要求相对较低。

已有研究表明，微小RNA与髓母肿瘤有密切关系。

另外，我们课题组之前的研究发现髓母细胞瘤是一种受甲基化调控的疾病，多个与髓母相关的抑癌基因因受髙甲基化调控而失活，而这种失活
是可逆转的。

但是关于髓母中具有抑癌功能的受甲基化调控的微小RNA报道很少。

⏹我们的一部分工作就是在髓母细胞瘤中筛选出一部分有可能被高甲基化调控的微小
RNA, 其中就包括了miR449a。

在经过了分子亚型分类的髓母细胞瘤中检测发现, miR-449a是潜在的WNT亚型髓母的诊断标志物。

⏹神外前沿：除了您提到的nanostring的方法，髓母的分子分型用其它方法是如何实
现的？
常青：方法很多，最常用的是免疫组化套餐方法。

但免疫组化存在的主要问题是很难统一诊断标准，各个实验室之间的质量控制很难实现，国际上目前也没有公认的克隆号统一的抗体套餐能够将髓母的4个亚型清晰地分辨出来。

⏹神外前沿：Nanostring应用到临床的话，成本高不高？
⏹常青：我们目前正在核算成本，但是从国外已有报道来看，其成本相对于二代测序
等是要低的。

⏹神外前沿：除了鉴别分型，在髓母细胞瘤的治疗上能有什么帮助吗？
常青：目前我们能证明mir449a可能是分子亚型诊断标志物，研究还刚刚展开，我们还有很多潜在的研究领域，包括探索Mir-449a的靶基因, 如果能进一步筛选出与药物治疗相关的靶点，将会为髓母患者带来福音。

脑胶质瘤分子标志物大盘点
2019-05-16 05:12
【引言】
很多人对脑胶质瘤谈虎色变，认为它就是恶性程度最高的“脑癌”，复旦大学附属华山医院的吴劲松教授却提出了一个大胆的新观念，低级别的脑胶质瘤应该称之为慢性的肿瘤性疾病。

因此，脑胶质瘤的分类对我们清楚的认识这一疾病有非常重要的意义。

传统脑胶质瘤根据肿瘤细胞的形态学、肿瘤细胞的恶性程度以及肿瘤所处的部位进行分类，按肿瘤细胞在病理学上的恶性程度分为：Ⅰ～Ⅳ级。

低级别胶质瘤指的是二到三级的胶质瘤，组织病理学上称为lower grade。

随着分子生物学的发展，分子病理诊断的兴起，脑胶质瘤的分子分型越来越重要，最新2016版WHO中枢神经系统肿瘤指南中强调了这点。

这时候再谈低级别胶质瘤有可能包含两层意思，一个是按组织病理学分类主要为二级的，部分为三级的胶质瘤，符合lower grade较低级别的胶质瘤；第二个就是分子病理预后指标是比较优越的，比如IDH突变，1p/19q共缺失的，ATRX突变等，这一类的病人预期寿命可以在10年以上。

所以我们现在强调胶质瘤也要做分子诊断，不能满足于一个普通的组织病理学诊断，要结合分子诊断结果，比如荧光定量PCR、FISH、一代、二代测序，这些方法都已写进2016版WHO中枢神经系统肿瘤指南中。

【脑胶质瘤中涉及的分子标志物】
(一)IDH突变
异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase）IDH，有三种异构酶形式（IDH1/2/3），IDH1/2存在于体细胞突变，是肿瘤早期发生的现象。

目前认为IDH突变是低级别胶质瘤(星形细胞瘤，少突胶质瘤)和继发性胶质母细胞瘤（GBM）的重要标记物。

具有显著的预后价值：存在IDH基因突变的患者预后较好，无进展生存期和总生存期也较长。

IDH野生型患者的预后则较差，无进展生存期和总生存期相对较短。

IDH 突变状态可辅助诊断胶质瘤。

检测方法：sanger测序、R132H抗体IHC。

(二)MGMT 启动子甲基化
六氧-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(O6-methylguanine-DNA-methyltransferas,MGMT) 是一种重要的DNA修复酶，能够迅速修复由烷化剂药物引起的DNA烷基化损伤,从而使细胞对烷化剂产生耐受。

MGMT基因启动子富含CpG岛，正常处于非甲基化状态，甲基化MGMT在脑胶质瘤组织中的表达与肿瘤的耐药性有关，MGMT 启动子甲基化提示胶质母细胞瘤（GBM）患者预后较好。

检测方法：高分辨率熔解曲线(High Resolution Melt,HRM) PCR法
(三)染色体 lp/19q 共缺失
在胶质瘤中，1p和19q的缺失与肿瘤中的少枝胶质细胞成分有关，在低级别胶质瘤中，70％的少突胶质瘤和60％的间变性少突胶质瘤中可检测到二者的共缺失异常。

共缺失患者对放疗和化疗效果好，提示着较长生存期，预后相对良好。

检测方法：荧光原位杂交（FISH）、基于杂合性缺失分析的聚合酶链式反应(PCR) 和阵列比较基因组杂交(CGH)。

推荐采用FISH法。

(四)TERT启动子突变
端粒酶逆转录酶(Telomerase reverse tranase,TERT)启动子区突变，是近年来发现的另1个胶质瘤分子标志物，突变主要集中在启动子区的C228T和C250T两个位点，总突变率在50%左右。

在原发性胶质母细胞瘤中TERT突变可达58%以上，继发胶质母细胞瘤中占28%。

在IDH突变亚群中，TERT突变的患者预后更好，在IDH野生亚群中，TERT突变患者的预后反而更差
检测方法：对外显子区域进行PCR，Sanger测序
(五)EGFR 扩增和EGFRvⅢ重排
表皮生长因子受体( epidermal growth factorreceptor，EGFR)基因定位于染色体7p12，编码一种跨膜酪氨酸激酶受体( EGFR/Erb/Herl)。

EGFR基因变异普遍发生肿瘤细胞中，在脑胶质瘤中也有很高的发生率。

间变性星形细胞瘤中EGFR扩增的发生率为17%，GBM中的发生率为50%- 60%，由于小细胞GBM 中EGFR扩增很普遍，据此能鉴别诊断小细胞GBM与高级别的少突胶质细胞瘤。

在临床上，60岁的CBM患者伴随EGFR扩增提示预后不良。

存在ECFR扩增的肿瘤可以伴发其他EGFR基因的改变，最常见的是外显子2-7框内缺失形成的EGFRvⅢ重排，EGFRvⅢ重排在GBM患者的发生率为20% - 30%。

EGFR的扩增会导致EGFRvⅢ成为截断体蛋白，从而不能绑定配体的短胞外区。

EGFRvⅢ重排能够激活下游信号转导通路。

EGFRvⅢ重排是否与预后相关还存在着争议，但是长期来看，有EGFRvⅢ重排的患者预后有差的趋势。

检测方法：EGFR扩增：FISH法；EGFRvⅢ重排：实时定量PCR，IHC，多重探针依赖式扩增技术。

推荐FISH检测EGFR重排。

(六)PTEN 基因突变
磷酸酯酶与张力蛋白同源物( phosphatase andtensin homolog，PTEN)，定位于染色体lOq23.3，PTEN是重要的抑癌基因，参与信号通路的转导，在细胞生长、分裂的速度过快或者分裂不受控制时，能够调控细胞分裂周期，使细胞停止分裂并诱导凋亡，这些功能可以阻止细胞的异常增殖进而限制肿瘤的形成。

PTEN基因是众多肿瘤预后的评价指标，PTEN参与了RTK/PI3K通路，86%的GBM患者会有包括PTEN 基因缺失和突变的RTK/PI3K通路基因的改变。

在原发性GBM中PTEN的点突变率为26% - 34%。

间变性星形细胞瘤(18%)突变率明显少于GBM。

有PTEN突变的间变性星形细胞瘤患者预后较差。

检测方法：对外显子区域进行 PCR，Sanger 测序。

(七)TP53 基因突变
TP53为抑癌基因，定位于染色体17p13.1，编码蛋白称为p53蛋白。

p53蛋白能调节细胞周期和避免细胞癌变发生。

超过50%的人类肿瘤涉及TP53基因突变的发生。

TP53基因突变在低级别星形细胞瘤中发生率为50% - 60%，在少突胶质细胞瘤中TP53基因突变发生率很低，混合性少突星形细胞瘤发生率为40%，继发性GBM发生率为70%，原发性GBM发生率为25% -37%。

TP53 突变在低级别星形细胞瘤和继发 GBM 中发生率高。

有 TP53 突变的低级别胶质瘤预后较差。

但是对GBM而言并没有预测价值。

检测方法：对外显子区域进行PCR，Sanger测序检测TP53突变。

(八)BRAF 融合和点突变
BRAF基因位于7q34，是RAF家族的成员之一，RAF家族还包括ARAF和RAFl( CRAF)基因，是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK通路重要的转导因子，参与调控细胞内多种生物学事件，如细胞生长、分化和凋亡等。

BRAF基因的串联重复导致了基因的融合，如KIAA1549-BRAF和FAM13IB-BRAF（少见）。

KIAA1549-BRAF融合在毛细胞型星形细胞瘤中高发（50% - 70%），而在其他级别胶质瘤或其他肿瘤中极为少见。

检测有KIAA1549-BRAF融合则高度提示为毛细胞型星形细胞瘤。

可作为与CBM 区分的重要的诊断标志物，
另外，各个级别的胶质瘤中，均检测到了BRAF V600E突变。

多形性黄色瘤型星形细胞瘤中约有60% - 70%发生该突变，是突变最多的一种星形细胞瘤。

在毛细胞型星形细胞瘤中发生率为10%，
其他胶质瘤中少见。

KIAA1549-BRAF 融合基因和 BRAF V600E 突变与毛细胞型星形细胞瘤密切相关，具有很强的诊断价值;是靶向治疗的标志物。

检测方法：KIAA1549-BRAF基因融合：FISH法，实时定量PCR；BRAF V600E突变：免疫组织化学，焦磷酸测序。

(九)CDKN2A
CDKN2A基因位于9号染色体短壁上，9p21，是一个肿瘤抑癌基因。

CDKN2A基因纯合性缺失可见于11%Ⅱ级，47%Ⅲ级，和60%Ⅳ级胶质瘤，发生于18%原发性脑胶质瘤和43%的复发性脑胶质瘤中，与肿瘤进展相关，为预后胶质瘤预后不良因子,
检测方法：采用FISH法进行 CDKN2A/CEP 9检测
【结语】
近年来，胶质瘤的分子生物学分型越来越得到专家们的重视，相信会有越来越多的病人受益于此，当然这需要依赖技术与病理医生共同努力。