C57胚胎小鼠神经干细胞的分离_培养与鉴定_万丽_易桦林_贝伟剑

作程序， 但 NSCs 对培养条件和操作技术要求较高， 不同发育阶段脑组织的选择、 细胞分离消化和接种 传代方式、 培养基成分等细节的改变都会影响 NSCs 的培养结果， 因而如何获得稳定、 体外增殖能力和低 密度成球能力强、 能够反复传代的 NSCs 是 NSCs 研 ［8 ］ 究的基本问题 。 本研究从特定发育阶段脑组织 获取细胞， 通过分离培养方法的不断优化， 建立从 12．5 d 的 C57 孕鼠胚胎脑中分离培养 NSCs 的方法。
此， 研究 NSCs 的生物学对于神经系统损伤修复和 ［34 ］ 。临床应用中， 退行性病变的治疗具有重要意义 NSCs 的来源和数量有限是目前存在的主要问题。 NSCs 的体外培养和扩增对于实现其潜在价值 因此， ［56 ］ 。NSCs 的体外获取可通过直接从 具有重要作用
基金项目： 广东省教育部产学研结合项目（ 2012B091100193） ； 广州市科技计划助资项目（ 11C32130738） 39352607， Email： 1075519171@ qq． com； 通信作 主要从事中药药理研究， 电话： 020作者简介： 万丽（ 1988—） ， 女， 硕士研究生， Email： beiwj2000@ aliyun．com。 者： 贝伟剑（ 1963—） ， 研究员， 主要从事中药药理研究和新药研发， 男， 博士， 0516 9： 55 网络出版时间： 2014网络出版地址： http： / / www．cnki．net / kcms / detail /44．1413．Ｒ．20140516．0955．001．html
第3期
等 ．C57 胚胎小鼠神经干细胞的分离 、 培养与鉴定 万丽，
355
神经组织分离培养、 其他来源干细胞的诱导分化、 永 主要通过悬浮生长和贴 生化的 NSCs 3 种途径实现， 壁 培 养 2 种 方 式 进 行 体 外 扩 增。 悬 浮 神 经 球 （ neurosphere assay ， NSA ） 是 NSCs 体外培养中最常 用的方式， 该法基于 NSCs 在体外无血清培养基中 可依赖有丝分裂原的维系、 悬浮成球生长、 维持自我
广东药学院学报
Journal of Guangdong Pharmaceutical University
Jun． 2014， 30（ 3）
C57 胚胎小鼠神经干细胞的分离 、 培养与鉴定
1 2 1 万丽 ， 易桦林 ， 贝伟剑
（ 1． 广东药学院 中医药研究院 / 广东省代谢性疾病中医药防治重点实验室， 国家中医药管理 局高脂血症调肝降脂重点研究室 / 国家中医药管理局脂代谢三级实验室， 广东 广州 510006 ； 2． 中山大学 生命科学学院干细胞研究室， 广东 广州 510006 ）
情况和形态变化。 待细胞生长密度达到 ＞ 80% 长满 时， 对贴壁部分和悬浮部分分别用 0．125% 的胰蛋白 酶消化 3 min， 分开培养， 至第 3 代 （ P3 ） ， 可以得到 较纯且活性较好的神经干细胞球。 1．2．3 1．2．3．1 C57 胚胎小鼠的 NSCs 的鉴定 光镜观察 倒置显微镜下观察不同时间点 神经干细胞和神经球的形态。
2
2．1
结果
C57 胚胎小鼠 NSCs 的分离、 培养与纯化
分离 得 到 的 C57 胚 胎 小 鼠 的 NSCs 光 镜 下 可 见， 原代细胞接种后， 部分细胞逐渐沉降贴附于 6 孔 板表面， 胞体较小， 有光晕， 悬浮部分可以看到很亮 的圆形细胞组成的细胞团。第 2 天以后可看到细胞 大部分贴壁， 悬浮细胞较亮且较圆， 很多细胞团块成 。 辐射状贴壁生长 悬浮部分可以看到一些由十几个 细胞组成的桑葚状神经小球悬浮生长 ， 如图 1A。 接 种第 3 天之后， 神经小球直径逐渐增大， 贴壁的细胞 团块颜色逐渐变暗。原代培养中可见神经球周围无 明显刺突， 存在明显细胞聚集， 如图 1B 。
［7 ］ 更新和未分化状态的特点发展建立起来 。 尽管 神经球法相对简单易行， 不同实验室提出各自的操
开腹腔， 暴露两侧子宫， 用眼科镊钳住子宫头端， 顺 子宫分离至子宫角处剪下， 放入有冰 PBS 溶液培养 皿中， 依次去除子宫壁和胎膜， 仔细分离得到脑组 织， 手动法得到胎鼠脑细胞。冰的 DMEM / F12 洗涤 1 遍， 加入 0．01% （ φ ） 的胰蛋白酶， 在恒温培养摇床 DMEM / F12 终止消化。 用 100 上 37 ℃ 消化 30 min， 1 000 r / min， 目筛子过滤， 收集于离心管中， 离心 3 min， 去上清， 加入已配制好的 NSCs 培养基（ 含 NSCs 2% B27、 20 ng / mL EGF、 20 ng / mL 基 础 培 养 基、 bFGF） 制成单细胞悬液， 细胞计数之后， 加入 6 孔板 。 3 1 。 中原代培养 每 天换 次液 1．2．2 C57 胚胎 小 鼠 NSCs 的 培养 和 纯 化 在相差 显微镜下每天观察小鼠 NSCs 的贴壁及悬浮、 生长
Isolation， culture and identification of neural stem cells from C57 embryonic mice
WAN Li1 ， YI Hualin2 ， BEI Weijian1 （ 1．Guangdong TCM Key Laboratory for Metabolic Diseases， Key Laboratory of Modulating Liver to Treat Hyperlipemia SATCM， and Level 3 Laboratory of Lipid Metabolism SATCM， Institute of Chinese Medicinal Sciences，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China； 2． Stem Cell Ｒesearch Department， School of Life Sciences， Sun Yatsen University， Guangzhou， 510006， China） Abstract： Objective To isolate， culture and identify the neural stem cells （ NSCs ） ． Methods NSCs from fetal mice were isolated by dissection and enzymatic digestion， and cultured in the optimal serumfree NSC medium． The specific biomarker of NSCs was detected by immunocytofluorescent assay． Ｒesults The isolated NSCs adhered to the culture plate within 48 h， and nestlike clusters of NSCs were obtained in the culture suspension in about 3 d． On the 3th passages of NSCs， adherent cells are rarely seen， and nearly all were neurospheres with spinule． Nestin was expressed in the cultured cells． Conclusion NSCs are successfully isolated and cultured from fetal C57 mice， and could proliferate in vitro． Key words： C57 embryonic mice； neural stem cells； cell culture； nestin
NSCs ） 具有分化为 神经干细胞 （ neuralstemcell， 神经元、 星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力 ， 能自 。 我更新， 并足以提供大量脑组织细胞的细胞群 ， ， NSCs 现已发现 多种类型的中枢神经系统损伤后 被激活并有利于组织的损伤修复和功能恢复 。 因
0402 收稿日期： 2014［12 ］
1．2．3．2
NSCs 标 志蛋 白 nestin 表 达 的 检 测 将 P3 神经球转移至用 L多聚赖氨酸包被的盖玻片， 培养
DMEM / F12（ Hyclone 公司） ； PBS、 4% L多聚赖氨酸、 （ φ） 的多聚甲醛、 TritonX100 （ 鼎国生物技术有限公 司） ； 山羊血清（ 博奥森生物技术有限公司 ） ； 兔抗巢 蛋白（ nestin） 多克隆抗体（ 美国 Santa Cruz 公司） ； 羊 抗 兔 Dylight594 （ Earthox ） ； Hoechst33258、 封片液 （ Beyotime 公司） 。 1．1．2 主要仪器 高速冷冻离心机（ 德国 Eppendorf ） ； 水套式 CO 2 培养箱（ 美国 Shel Lab 公司 ） ； 荧光倒置 显微镜（ 德国 Zeiss 公司 ） ； 倒置相差显微镜 （ 日本 Olympus 公 司 ） ； BT224S 分 析 天 平 ［赛 多 利 斯 （ Sartorius） 科学仪器 （ 北京 ） 有限公司 ］ ； PUＲELAB PUＲELAB ULTＲA GE MK2 超纯 OptionS7 纯水机、 50 全 自 动 高 压 消 毒 锅 水 机 （ ELGA ） ； HVE（ Hirayama ） ； BCD499WX 冰 箱 （ Haier ） ； THZ103B 恒温培养摇床（ 上海一恒科学仪器有限公司） 。 1．1．2 实验动物 C57BL /6 小鼠， 180 d， 雌性， 购自 中山大学实验动物中心， 生产许可证号 SCXK （ 粤 ） 20110029。 1．2 方法 1．2．1 C57 胚胎小鼠 NSCs 的分离 将孕 12．5 d 的 C57 孕鼠断颈处死， 用酒精消毒之后， 沿腹正中线打
培养神经干细胞（ NSCs） ， 并对其进行鉴定。方法 采用手动法及胰蛋白酶消化法 摘要： 目的 体外分离、 分离胎鼠脑细胞， 用优化的无血清 NSCs 培养基进行培养。细胞免疫荧光法检测 NSCs 特异性标记分子 3 d 左右获得大量未分化呈巢状悬浮生长的 的表达。结果 分离的脑细胞体外培养 48 h 已大部分贴壁， 神经干细胞团。第 3 代时， 很少见到贴壁细胞， 几乎全是神经球， 神经球周围存在较多微刺 。 细胞表达 一种中间丝蛋白， 即巢蛋白（ nestin） 。结论 成功分离、 鉴定出 C57 小鼠 NSCs， 并可在体外条件下进行传 代扩增培养。 关键词： C57 胚胎小鼠； 神经干细胞； 细胞培养； 巢蛋白 中图分类号： Ｒ329 文献标志码： A doi： 10．3969 / j．issn．10068783．2014．03．022 8783（ 2014） 03035404 文章编号： 1006-
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至细胞大部分贴壁。 弃去细胞培养液， 用 PBS 洗 3 遍。加 4% 多聚甲醛固定 30 min， 加 PBS 冲洗 5 min × 3； 0． 2% Tritox100 室 温 破 膜 10 min， PBS 洗 涤 5 min × 3； 5% 的山羊血清室温封闭 30 min， PBS 洗涤 5 min × 3； 一 抗 nestin （ 1 ∶ 50 ） 4 ℃ 孵 育 过 夜、 二抗 DyLight 594 AffiniPure Goat AntiＲabbit IgG （ H + L ） （ 1 ∶ 100 ） 室 温 避 光 孵 育 l h， Hoechst33258 （ 1 μg / mL） 室温避光核复染 15 min， PBS 冲洗 2 遍， 封片， 显微镜观察。
1
1．1
材料与方法Βιβλιοθήκη Baidu
材料 试剂
1．1．1
NSCs 基础培养基 （ 中山大学生科院 干细 胞 中 心 张 雁 教 授 惠 赠 ） ； B27 （ Gibco 公 司 ） ； bFGF （ ProSpecTany TechnoGene Ltd． 公 司 ） ； EGF （ ProSpecTany TechnoGene Ltd． 公 司 ） ； 胰 蛋 白 酶、