干扰素制备的工艺流程

八、目的基因与表达载体的组合与导入
❖ 表达载体：PBV220,，将PBV220和目的基因用双酶切法处理， 退火后连接，构建重组质粒，利用CaCl2法导入到宿主大肠 杆菌中，构建工程菌，在培养基中培养，利用干扰素性质鉴 定目的工程菌，分离工程菌，扩大培养，提取出质粒，分析 质粒稳定性。
干扰素的发酵工艺过程
七、对重组质粒的检测与目的基因提取
❖ 目的基因获取 ❖ 对获得的质粒进行双酶切，获得目的基因与PBR322质粒片
段，通过琼脂糖凝胶电泳，由于目的基因与PBR322质粒片 段相对分子量不同，在电泳过程中产生不同的条带，通过与 已知基因长度的对比，我们可以选出相应的目的基因，接着 利用Qiagen纯化柱回收纯化DNA。具体：用3倍体积的特殊 高盐溶液于55°融化带有目的基因的DNA片段的琼脂糖凝胶 块，将DNA释放到水溶液中。然后将其通过Qiagen纯化柱， 经过如图结合—洗涤—洗脱步骤，直接得到纯化的DNA样品。 ❖ 利用核酸探针杂交法鉴定目的基因
❖ ４）加15nl(20ml)用冰预冷的溶液Ⅲ。 溶液Ⅲ: 5mol/L乙酸钾 60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml
❖ 所配成的溶液对钾是３mol/L，对乙酸根是5mol/L。 封住瓶口，摇动离心瓶数次以混匀内容物，此时应不再出现 分明的两个液相。置冰上放10分钟，应形成一白色絮状沉淀。 于0℃放置后所形成的沉淀应包括染体DNA、 高分子量RNA和 钾－SDS－蛋白质－膜复合物
❖ ７）用合适转头于室温以500转/分离心15分钟，回收核酸。 如于4℃离心，盐也会了生沉淀。
❖ ８）小心倒掉上清，敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽， 于室温用70％乙醇洗涤沉积管壁。倒出乙醇，用与真空装置 相联的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴，于室温将瓶倒置放 在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥殆尽。
❖ ５）用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟，不开刹车而 使转头自然停转。如果细菌碎片贴壁不紧，可以5000转/分 再度离心20分钟， 然后尽可能将上清全部转到另一瓶中， 弃去残留在离心管内的粘稠状液体。未能形成致密沉淀块的 原因通常是由于溶液Ⅲ与细菌裂解物混合不充分
❖ ６）上清过滤至一250ml离心瓶中，加0.6体积的异丙醇，充 分混匀，于室温放置10分钟。
❖５）加500μl含13％（w/v)聚乙二醇（PEG 8000）的 1.6mol/L NaCl,充分混合，用微量离心机于４℃以 12000g离心５分钟，以回收质粒ＤＮＡ。 ６）吸出上清，用400μl TE(pH8.0)溶解质粒DNA沉淀。 用酚、酚：氯仿、氯仿各抽１次。 ７）将水相转到另一微量离心管中，加100μl 10mol/L乙醇铵，充分混匀，加２倍体积（约1ml）乙 醇，于室温放置10分钟，于4℃以12 000g离心5分钟， 以回收沉淀的质粒ＤＮＡ。 ８）吸去上清，加200μl处于4℃以12 000g离心2分钟。 ９）吸去上清，敞开管口，将管置于实验桌上直到最 后可见的痕量乙醇蒸发殆尽。 10）用500μl TE（pH8.0）溶解沉淀1:100稀释[用TE （pH8.0)] 后测量OD 260，计算质粒DNA的浓度 （1OD260＝50μg质粒DNA/ml）， 然后将DNA贮于－ 20℃。
❖ 流程：步骤一：将细菌涂布到含氨苄青霉素的培养基上培养， 就可得到质粒PBR322或重组质粒的细菌单菌落。
❖
步骤二：步骤一获得的每一个细菌单菌落标记为a、b、
c、d等，在每一个单菌落中挑取部分细菌转涂到含有四环素
的培养基上，不能生长的是绝大部分含有重组质粒的细菌及
少量可能发生突变的非重组质粒的细菌单菌落。原因：因为
❖ (2). 温度控制
假单孢杆菌生长最适温度与产物形成
最适温度是不同的。产物合成温度控制在20℃可以有效防止
干扰素-α2b的降解，而其最佳生长温度则为30℃。质粒的
稳定性随温度的升高而迅速下降，因此在培养后期降温可以
减少目标产物的降解，增加质粒的稳定性。
❖ (3)．pH值
发酵过程中，pH的变化由工程菌的代
❖ 4. 菌体收集 将已降温的发酵液转入连续流离心机， 16000 r/min离心收集。进行干扰素含量、菌体蛋白含量、 菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性等项目的检测。 菌体于－20℃冰柜中保存时，不得超过12个月。每保存3个 月，检查一次活性。
干扰素发酵过程控制
❖
在假单孢杆菌的发酵生产中，菌体在培养1.5小时分裂
谢、培养基的组成和发酵条件所决定。干扰素-α的等电点
在pH 6.0附近，在低酸性条件下稳定，能耐受pH 2.5的酸性
环境。因此可在发酵后期降低pH，从而造成大量蛋白酶失活，
减少干扰素-α的水解，提高干扰素的积累量。
半成品检定
❖ （1）效价测定 用细胞病变抑制法，以Wish细胞、VSV病毒为基本检测
❖ ２）加1ml(2ml)新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,溶于 10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)]。当溶液的pH值低于8.0时，溶 菌酶不能有效工作。 ３）加20ml(40ml)新配制的溶液Ⅱ。 溶液Ⅱ: 0.2mol/L NaOH(临用前用10mol/L贮存液现用现稀释） 1％SDS 盖紧瓶盖，缓缓颠倒离心瓶数次，以充分混匀内容物。于室 温放置5-10分钟。
❖ 3、碱裂解法 １）将冼过的500ml 培养物的细菌沉淀物[ 来自收获细菌的 步骤3] 重悬于10ml（18ml）溶液Ｉ中。 溶液Ｉ: 50mmol/L葡萄糖 25mmol/L Tris.Cl(pH8.0) 10mmol/L EDTA(pH8.0) 溶液Ｉ可成批配制，在10 lbf/in2(6.895x104Pa)高压下蒸 气灭菌15分钟，贮存于４℃。
扰素基因的PCR产物
二、目的基因与克隆载体进行体外重组
❖ 1. 提取载体（质粒、病毒等），双酶切，再把干扰素基因
的PCR产物用相应的酶酶切，用连接酶连接
EcoR I
BamH I
EcoR I
BamH I
2.连接完成后分离纯化，测序，与原干扰素序列比对。 3.鉴定序列无误后（无义突变也行），导入受体细胞，筛选
❖ （5）相对分子量测定
❖
还原型SDS-PAGE，加样量不地域微克，同时用已知相
对分子量的蛋白标准系列做对照，以迁移率为横坐标，相对
分子量的对数为纵坐标作图，计算相对分子量。与理论值比
较，误差不得高于10%。
❖ （6）残余外源性DNA含量测定
❖ ９）用3ml TE(pH8.0)溶解核酸沉淀。
❖ 10）纯化。
六、质粒DNA的纯化
❖ （一）聚乙二醇沉淀法提取质粒ＤＮＡ
１）将核酸溶液所得]转入15mlＣorex 管中， 再加3ml 用冰预冷的 5mol/L LiCl溶液，充分混匀，用合适转头于４℃下以10 000转/分离心 10分钟。LiCl可沉淀高分子RNA。 ２）将上清转移到另一30mlCorex管内，加等量的异丙醇， 充分混匀， 用SorvallSS34转头（或与其相当的转尖）于室温以10 000转/分离心10 分钏， 回收沉淀的核酸。 ３）小心去掉上清，敞开管口，将管倒置以使最后残留的液滴流尽。于 室温用70％乙醇洗涤沉淀及管壁，流尽乙醇，用与真空装置相连的巴其 德吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞开管口并将管侄置，在纸巾上放置 几分钟，以使最后残余的痕量乙醇蒸发殆尽。 ４）用500μl含无DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml ）的TE（pH8.0）溶解沉淀， 将溶液转到一微量离心管中，于室温放置30分钟。
❖ 2、细菌的收获和裂解 １）用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟，弃上清，敞 开离心管口并倒置离心管使上清全部流尽。
❖ ２）将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。 STE 0.1mol/L NaCl 10mmol/L Tris.Cl(pH8.0) 1mmol/L EDTA(pH8.0) 按步骤１）所述方法离心，以收集细菌细胞。
速度最快，到3.5小时开始下降。而干扰素的迅速合成出现
在3.5小时之后，在4小时达到最大，然后由于降解而迅速下
降。可见在发酵生产工艺中，假单孢杆菌的生长和干扰素的
生产基本处于不相关状态，可采用两段培养的策略进行过程
控制。
❖ (1)．溶解氧控制 分别在生长阶段和生产阶段采用各自 最佳溶解氧浓度，以期提高干扰素的发酵水平。通过级联调 节通气量和搅拌转速得以实现。
重组体导入大肠杆菌K12
→
→
受体菌的培养及筛选 从受体菌中获取目的基因
表达载体
重组质粒
导入大肠杆菌
→
受体菌的筛选，表达性、稳定性等检测
工程菌
一、目的基因的分离与获得
❖ 1. 设计合成干扰素基因的两端引物（完全的），每条引物 内或5‘-端最好有内切酶酶切位点。
❖ 2. 有药物诱导细胞，如佛波酯，使细胞表达干扰素升高。 ❖ 3. 破碎细胞，提取细胞总mRNA. ❖ 4. 用逆转录试剂盒逆转录，把总mRNA逆转录成cDNA ❖ 5. 以cDNA为模板、干扰素引物为引物，PCR，得到完全的干
启开种子 精提 冻干
制备种子液 半成品制备
成品检定
发酵培养 半成品检定
成品包装
粗提 分装
❖ 1．菌种制备
取－70℃下保存的甘油管菌种（工作种
子批），于室温下融化。然后，接入摇瓶，培养温度30℃，
pH7.0，250 r/min活化培养18±2小时后，进行吸光值测定
和发酵液杂菌检查。
❖ 2．种子罐培养
PBR322含有抗四环素Байду номын сангаас因，重组质粒中目的基因插在抗四环
素基因中，使其结构破坏，失去抗四环素作用。
五、提取重组质粒
❖ 1、对上一步获得含目的基因的大肠杆菌在含有氯霉素的培 养基中扩大培养15h。培养时间：前人实验证实大肠杆菌K12 生长前6h为迟缓期, 6~15. 5h为对数增时期, 15. 5~ 19. 5h为稳定期, 19. 5h后为衰亡期。氯霉素：氯霉素可抑制宿 主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松 弛型质粒仍可继续复制。
α干扰素又依其结构分为 α1b、α2a、α2b等亚型
其区别在于个别氨基酸 的差异上，早期干扰素是用 病毒诱导人白血球产生的， 产量低、价格昂贵，不能满 足需要，现在可利用基因工 程技术并在大肠杆菌中发酵、 表达来进行生产。
基因工程菌的制备
❖ 目的基因的分离 克隆载体
→ 目的基因与克隆
载体的体外重组
将已活化的菌种接入装有30L培养基的
种子罐中，接种量10%，培养温度30℃，pH7.0，级联调节通
气量和搅拌转速，控制溶解氧为30%，培养3～4小时，转入
发酵罐中，同时取样发酵液进行显微镜检查和LB培养基划线
检查，控制杂菌
❖ 3.发酵罐培养 将种子液通入300L培养基的发酵罐中，接 种量10%，培养温度30℃，pH7.0。级联调节通气量和搅拌转 速，控制溶解氧30%，培养4小时。然后控制培养温度20℃， pH6.0，溶解氧60%，继续培养5～6.5小时。同时进行发酵液 杂菌检查，当OD值达9.0±1.0后，用5℃冷却水快速降温至 15℃以下，以减缓细胞衰老。或者将发酵液转入收集罐中， 加入冰块使温度迅速降至10℃以下。
三、重组体引入宿主细胞
将cDNA克隆到含有四环素、氨苄青霉素抗性基因的质 粒pBR322中，转化到大肠杆菌，重组的载体 DNA 分子在一 定条件下转化入大肠杆菌，形成携带质粒的菌株。
四、从大肠杆菌k12获取目的基因
由于质粒重组时有3种基本方式，即：目的基因与克隆载体
重组，目的基因片段与目的基因片段重组，克隆载体与克隆 载体重组；另外重组过程可能会发生基因突变情况
干扰素制备的工艺流程
生命科学学院 生物技术 2010级7班
什么是干扰素？
❖ 概念(interferon,IFN)：机体免 疫细胞产生的一类细胞因子，是 机体受到病毒感染时，免疫细胞 通过抗病毒应答反应而产生的一 组结构类似、功能接近的生物调 节蛋白。
❖ 根据分子结构和抗原性的差异分 为α、β、γ、ω等4个类型。
系统，测定中必须用国家或国际参考品校准为国际单位。
❖ （2）蛋白质含量测定
❖
福林-酚法，以中国药品生物制品检定所提供的标准蛋
白为标准。
❖ （3）比活性
❖
效价的国际单位与蛋白质含量的毫克数之比。
❖ （4）纯度
❖
电泳纯度用非还原型SDS-PAGE法，银染显色应为单一
区带，经扫描仪测定纯度应在95%以上。