组织工程学-第七章

制备 H2SO4/H2O2处理玻璃表面 硫酸铬处理玻璃表面 在玻璃表面成膜 处理玻璃表面 在玻璃表面成膜 在玻璃表面成膜 在玻璃表面成膜 处理玻璃表面
0.4 Fibronectin adsorption (µg/cm )
2
I125标记的纤粘连蛋白在不同亲水性表面的吸附（左）和脱附（右） 100
Fibronectin desorption (%) 80 60 40 20 0 0 30 60 90 120 Water contact angle (deg)
【举例】微槽表面
M. Yoshinari, et al.，Effects of multigrooved surfaces on fibroblast behavior，J Biomed Mater Res 65A: 359–368, 2003 成纤维细胞在不同微槽表面上的培养结果 左列：光学显微镜 右列：激光共聚焦 显微镜 (鼠成肌细胞) 平滑表面 20µm宽微槽 250µm宽微槽 采用相分离微制造工艺制备的多孔微槽膜 Bernke J. Papenburg, et al., One-step fabrication of porous micropatterned scaffolds to control cell behavior, Biomaterials 28 (2007) 1998–2009 16µm宽相通微槽
电势
表面电势影响溶液中的离子分布，并影响与蛋白质的相互作用
后处理：85℃/1h
猪的成纤维细胞在不同基底上培养48h后 细胞增殖抑制指数（CPII）= 100%-(实验样中细胞平均数 / 对比样中细胞平均数×100）% 猪的3T3成纤维细胞在不同基底上的生长曲线 (对比样：组织培养用聚苯乙烯)
pHEMA
1.6 Cell proliferation (OD)
0.3
பைடு நூலகம்
0.2
1.2
0.1
0.8
0.0 0 30 60 90 120 Water contact angle (deg)
0.4
0.0 0 30 60 90 120 Water contact angle (deg)
亲水性高分子接枝表 面减少蛋白吸附
【结果】 PLLA 接触角 72.2 ± 2.4 PLLA-g-PHEMA 40.1 ± 3.6 PLLA-g-PAAm 41.8 ± 3.7 PLLA-g-PMAA 39.8 ± 4.4
黑色：24h贴壁率 （相对TCPS的％） 紫红：细胞增殖速率 （%, 4d） 白色：细胞活力 （相对TCPS的％, 4d）
-
将甲基丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸和丙烯酰胺通过光引发聚合接枝到 聚乳酸表面，然后进行软骨细胞的培养。
CH3 H2C O CH2CH2OH
CH3 H2C OH O
MAA
H2C CH NH2 O
AAm
OH
O
细胞膜的结构模型
唾液酸（N-乙酰神经氨酸）
HEMA
Zuwei Ma, et al., Biomaterials 24 (2003) 3725–3730
第 7 章 细胞与材料的相互作用
7.1
概述
组织工程学
聚合物支架对组织生长发育过程的影响： 1）大尺度范围（mm～cm）决定工程化组织的性状和大小； 2）支架孔隙的形态结构和大小（um）调节细胞的迁移与生长； 3 ）用于制造支架的材料的表面物理和化学性质（nm）调节与其相 接触的细胞的黏附、铺展与基因表达过程。
7.2.3 材料的表面亲疏水性
研究表明，中等润湿性表面对细胞粘连最多。这和蛋白质在表面 吸附相关。
○和■：成纤维细胞 ●和△：内皮细胞
具有不同亲水性表面的材料的准备
材料 玻璃 I 玻璃 II 醋酸纤维素 氨基丙基硅烷 聚氨酯 聚氯乙烯 蛋白质在表面粘附的几种可能相互作用机理 聚苯乙烯 硅油
水接触角 0 20 57 63 72 83 90 105
7.2.1 材料的表面形态
与光滑表面相比，上皮细胞和成纤维细胞更易附着于微粗糙表面 （在10nm～50um范围内），而且在该表面生长更快。 当孔径较小时（如2～5um）细胞在其表面的生长速率要比孔径大 时（如20um）大得多。 细胞能识别曲率变化，并沿非连续面生长（接触引导效应）。
鼠3T3成纤维细胞在聚乳酸膜表面的粘附生长
a：TCPS b： PLLA c ：PLLA-g-PHEMA d ：PLLA-g-PAAm e ：PLLA-g-PMAA
软骨细胞在不同表面的形态（Giemsa染色） (a)TCPS (b)PLLA (c)PLLA-g-PHEMA (d)PLLA-g-PAAm (e)PLLA-g-PMAA Bar = 100µm
应用温敏性表面实现图案化多种细胞培养
7.2.4 材料的化学结构
Yasuhiko Iwasaki et al., J Biomed Mater Res 2003，65A: 164–169
CH3 CH2 C C O O+
CH3
MPC
CH2
C C O
OCH2CH2OPOCH2CH2N (CH3)3
CH3 CH2 C C O
【举例】表面亲疏水性对细胞粘附行为影响规律的应用
CH C NH CH H3C
CH2
n
O
聚N－异丙基丙烯酰胺 LCST＝33oC
CH
CH2
CH
CH2
CH3
n
C NH CH H3C CH3 O C O C4H9 O
m
在接枝有PNIPAAm表面的细胞培养
聚N－异丙基丙烯酰胺——甲基 丙烯酸正丁酯共聚物（IB5） LCST＝20oC
表面的荷电特性 表面的亲/疏水性 表面的化学结构 表面自由能 材料的形态结构 材料形态结构 表面化学结构 表面荷电特性
7.2
细胞与材料的相互作用 7.2.1 材料的表面形态 7.2.2 材料的表面能 7.2.3 材料表面的亲疏水性 7.2.4 材料的化学结构 7.2.5 材料表面的基团特性 7.2.6 仿生表面 7.2.7 支架孔径对细胞粘附的影响 7.2.8 材料表面力学性能对细胞粘附影响 7.2.9 其他一些因素
人的成纤维细胞在具有不同亲水性的表面的增殖 图中的结果为培养72小时后染色，在450nm下所测得的光学密度数据。
相关知识：影响与蛋白质相互作用的材料表面性能
【举例】表面亲疏水性对细胞粘附行为的影响 C. Schiraldi, et al., Development of hybrid materials based on hydroxyethylmethacrylate as supports for improving cell adhesion and proliferation, Biomaterials 25 (2004) 3645–3653 【膜的制备】
【实验方法】
H CH
COOH H2C CH H C COOH H C PCl5 COOH PE-COOH
7
蔡 晴 材料科学与工程学院
形成“条件膜”
形成“生物膜”
细胞铺展生长 细胞在材料上的粘附机理图示 聚合物材料表面与生理性介质接触后可能发生的相互作用
影响细胞亲和性的因素
生物学因素 与细胞膜组成和性能相关的因素 材料因素 与材料表面性能相关的因素
细胞亲和性的材料因素及其影响效果
影 响 因 素 表面亲/疏水性 表面自由能 影 响 效 果
7.2.5 材料表面的基团特性
不同基团对细胞粘附的影响顺序为： －NH2 ＞ (CH3)2N－＞－OH＝－CONH2＞－SO3H＞－COOH
【实验目的】 将–OH， –COOH，–CONH2引入聚乳酸（PLLA）表面，研究不同基 团对细胞粘附的影响。 【实验方法】
CH3 O C NH CHOH CHOH CH2OH OH O COO
骨组织
纤维组织 植入体
假性聚酪氨酸
植入体
上图：poly(DTB carbonate)，约79％的 植入体发生异物反应，在植入体周围生 成纤维囊 下图：poly(DTE carbonate)，约72％的 植入体周围发现有骨组织的重塑
骨组织 高分子水化后的DSC测试结果 蛋白质原始构象的保持率
植入体与骨组织界面的组织学分析 ( Biomaterials 28 (2007) 4171–4177 )
+10% fumed silica
+23% fumed silica
人成骨细胞 在不同基底上培养24h的结果（×12,000） 【结论】 高亲水性的pHEMA水凝胶并不利于细胞的粘附和铺展生长，加入微球 10% microsilica 10% fumed silica 30% fumed silica 状SiO2后，虽有一定程度的改善，但由于微球粒径较大，提供的表面积有 限，并未获得均质基底表面，因此利于细胞粘附生长的表面并不连续。采用 猪3T3成纤维细胞在不同基底上培养1天（上）和5天（下）的结果 (×680) 雾化纳米SiO2后，基底表面性质得到显著改善，则可以极大程度地改变细胞 在其上的粘附和铺展生长行为。
左为37oC培养24h，右为在28oC培养24h
Yukiko Tsuda et al., J Biomed Mater Res 69A: 70–78, 2004
PIPAAm
IB5
常规表面培养
温敏表面培养
两种不同的细胞收获方式
利用细胞层的组织重建技术示例——角膜外上皮层的重建 Biomaterials 28 (2007) 5033–5043
O
O(CH2)nCH3
n = 3, BMA n = 11, DMA AAm
CH3 CH2 C C O
PLLA
PLLA－PC 3.0
CH2
NH2
H C
聚合物表面浸入人白细胞悬液24h后的电镜照片
N C O
VPy
OCH2CH2OH
HEMA
Kazuhiko Ishihara et al., J Biomed Mater Res, 39, 323–330, 1998.
材料性能 表面形貌 成分 疏水性 均匀性
影
响
织构表面曝露更多与蛋白质相互作用的区域 表面化学成分影响与蛋白质相互作用的分子间力 疏水性倾向于结合更多蛋白质 非均匀的表面性质导致形成不同的微畴，而与蛋白发生不同的 相互作用
将一定比例的粒径为40-60µm的 SiO2微球或雾化SiO2微球（平均粒径 为7nm），与甲基丙烯酸羟乙酯 （HEMA）混合均匀后，加入 AIBN，然后浇铸到两层玻璃板间进 行聚合。 预 聚 聚：60℃/1h 合：70℃/12h 膜的吸水率随fumed silica含量的变化
相对疏水性表面更利于细胞的粘附、生长 高表面能材料表面利于细胞的粘附与铺展 带正电荷材料表面与带负电荷细胞间的静电作用利于 细胞的粘附；带负电荷表面需要二价阳离子介导 氨基、酰胺基、羟基、羧基（？）、磺酸基等基团有 利于细胞的粘附与生长 微粗糙表面有利于细胞的粘附
细胞膜的荷电性质 细胞的亲/疏水性 细胞与材料的接触时间 细胞的代谢状态 细胞膜分子的运动方向 细胞膜的柔韧性
7d
21d
【举例】纤维表面
成骨细胞在聚酯纤维上的黏附生长
a
b
c
d
e
C2C12细胞在具20um宽微槽表面培养4天后， 在微槽不同高度层面的生长结果
成纤维细胞在PET纤维上的黏附生长
7.2.2 材料的表面能
具有高表面能的材料更利于对细胞的黏附和铺展。
PEP：氟代乙烯－丙烯共聚物 PE：聚乙烯 PS： 聚苯乙烯 PEU：聚氨酯 PSu：聚硫砜 PMMA：聚甲基丙烯酸甲酯 TCPS：组织培养用聚苯乙烯
0.2um 0.4um 1.0um
软骨细胞在聚碳酸酯微孔表面的行为
3.0um
成纤维细胞在不同微结 构表面的迁移
5.0um
J Appl Polym Sci 92: 2784–2790, 2004
【举例】岛屿结构表面
成纤维细胞在平面和具有95nm岛屿结构表面的粘附 接触5min（上）和30min后（下） M.J. Dalbya, et al., Fibroblast reaction to island topography: changes in cytoskeleton and morphology with time, Biomaterials 24 (2003) 927–935
【举例】微孔表面
×500 免疫荧光染色 注： A：微丝 T：微管 ×2500
孔径：孔间距（um） 孔深：4.8um 培养基质：石英玻璃 细胞：成纤维细胞
Catherine C. Berry, et al., Biomaterials 25 (2004) 5781–5788
成纤维细胞在不同微结 构表面的增殖