寿光鸡中禽网状内皮组织增生病毒的分离鉴定

离和鉴 定。分 离３ ， １ ２ 株Ｒ Ｅ Ｖ，对２ 株Ｒ Ｅ Ｖ的ｅ ｒ ｌ ｖ 基 因进行 了扩增 克隆和序列分 析 ，结 果显 示 ，２ 株Ｒ Ｅ ｖ 之 间的ｅ ｎ ｖ 基 因核 酸 同源性为９ ９ ． ８ ％，与分 离 自中国黑龙江 的ＨＬ Ｊ Ｒ ０ ９ ０ １ 和分 离 自中国台湾的Ｃ ｈ ｉ ｃ ｋ ｅ ｎ ／ ３ ３ ３ ７ ／ ０ ５ 亲缘 关系最近。 关键词 禽 网状 内皮组 织增生病毒 病毒分 离鉴 定 序 列比较
１ ． ３ 分离毒株ｅ ｒ ｗ基因的扩增、克隆和测序 １ ． ３ ． １ 模板ＤＮ Ａ的提取 Ｃ Ｅ Ｆ 在接 种Ｒ Ｅ Ｖ维 持６ ｄ 后收 获
细 胞 ，经 洗 涤 、 离心 沉 淀 再用 抽 提 缓 冲 液 （ １ ０ ０ ｍｍｏ ｌ ／ Ｌ
Ｎａ ＣＩ ・１ ０ ｍｍｏ ｌ ／ Ｌ Ｔ ｒ ｉ ｓ － ＣＩ ｐ Ｈ８ ． ０ ，２ ５ ｍｍｏ ｌ ／ Ｌ ＥＤＴ Ａ ｐ Ｈ８ ． ０ ・
１ 材料与方法
１ ． １ 病 料来源与背景
Ｄ ＮＡ连接Ｐ ＭＤ ． １ ８ Ｔ Ｖ ｅ ｃ ｔ ｏ ｒ（ Ｔ ａ Ｋ ａ Ｒ ａ ，大连） 后转化火肠杆 菌 感受 态细 胞 Ｄ Ｈ５ ａ ，随机 挑取 菌 落 以Ｐ ｌ ａ ｓ ｍｉ ｄ Ｍｉ ｎ ｉ Ｋｉ ｔ （ ＯＭＥ ＧＡ，ＵＳ Ａ ） 提取 质粒进 行酶切 鉴定 ，选取 鉴定为阳 性 克 隆予 送 上 海 生工 生物 工 程有 限公 司测 序 ，序 列 以
１ ． ３ ． ２ ｅ ｎ ｖ 基 因的Ｐ Ｃ Ｒ 扩增 参 照 已发表 的文献合成 了一 对 引物用 于扩增 分离毒株 的ｅ ｎ ｖ 基 因【 ５ 】 。反应 体系参照文 献 配 置 ， 扩 增 条 件 为 ：９ ５ ＂ Ｃ预 变性 ５ ｍｉ ｎ： ９ ５ ℃， ６ ０ ｓ ． ５ ５ ℃，５ ０ ｓ ，７ ２ ℃，２ ｍｉ ｎ ；３ ３ 个循环 ；７ ２ ℃，１ ０ ｍｉ ｎ 。 以正常Ｃ Ｅ Ｆ 基因组Ｄ ＮＡ 作 为阴性对 照。
２ ０ １ ３年第 ｌ Ｏ 期 （ 总第 ２ ０ １
试验研究
寿 光鸡 中禽 网状 内皮组 织增生病毒 的分离鉴定
中 颖 李兆华 王成森 （ 山东畜牧兽医职业学院 山东 潍坊 ２ ６ １ ０ ６ １ ）
摘要 对发 生肿瘤 的某寿光鸡群 随机抽取 ｌ ０ 只鸡接种鸡胚成 纤维细胞 进行针对禽 网状 内皮组织增 生病毒（ Ｒ Ｅ Ｖ ） 的分
１ ． ３ ． ３ 扩增 产物 的克 隆和 测序 将 Ｐ ＣＲ 扩增产 物经 １ ． ０ ％
琼 脂 糖 电泳 鉴 定 并 将 目的 条 带 切下 以Ｅ ． ｚ ． Ｎ． Ａ Ｇ ｅ ｌ
Ｅ ｘ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ Ｋｉ ｔ （ ＯＭＥ Ｇ Ａ ， ＵＳ Ａ ） 回 收 纯 化 ＤＮ Ａ ， 将 纯 化
Ｄ ＮＡ Ｓ ｔ ａ ｒ 软件 进 行 分 析 。
２ ０ １ ３ 年３ 月， 山东潍 坊某鸡场 饲养 的商 品代 寿光鸡发
生肿 痛病例 ．剖 检可 见肝脏 和脾 脏有 肿瘤 ，随机抽 取５ ０
只鸡翅静 脉采血 ，分 离血清后 分别用Ｒｅ ｔ ｉ ｃ ｕ ｌ ｏ ｅ ｎ ｄ ｏ ｔ ｈ ｅ ｌ ｉ ｏ ｓ ｉ ｓ
０ ． ５ ％Ｓ ＤＳ ） 悬浮 后 ，加 入蛋 白酶Ｋ （ １ ０ ０ ｕ ｇ ／ ｍｉ ） 消化过夜 ，再
－ Ｊ ｌ 乃 苯 酚 抽提 和 乙 醇沉 淀 后 ，溶 解 于 Ｔ Ｅ （ １ ０ ｍ ｍｏ ｌ ／ Ｌ Ｔ ｒ ｉ ｓ ． Ｃ ｌ ，
ｌ ｍｍｏ ｌ ／ Ｌ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ，ｐ Ｈ８ ． ０ ） 中 即为 样 品模 板 Ｄ ＮＡ （ ５ ０ ｎ ｇ ／ Ｉ ａ ｌ －
文献标识码 ：Ａ 文章编号 ：１ ０ ０ ７ － １ ７ ３ ３ （ ２ ０ １ ３ ） １ ０ ． ０ ０ ０ ５ ． ０ ３
行 间接 免 疫 荧 ３ ￣ （ Ｉ Ｆ Ａ ） 检￣ ｌ ｌ Ｊ ［ ４ ］ ．
中图分类号 ：￥ ８ ５ ２ ． ６ ５ ９
禽 网状 内皮组织 增生病 （ Ｒ ｅ ｔ ｉ ｃ ｕ ｌ ｏ ｅ ｎ ｄ ｏ ｔ ｈ ｅ ｌ ｉ ｏ ｓ ｉ ｓ ，Ｒ Ｅ ） 是 禽类 的一 种重要 的致肿 瘤性 疾病 ，其病 原禽 网状 内皮组 织增 生病毒（ Ｒ ｅ ｔ ｉ ｃ ｕ ｌ ｏ ｅ ｎ ｄ ｏ ｔ ｈ ｅ ｌ ｉ ｏ ｓ ｉ ｓ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ，Ｒ Ｅ Ｖ ） 是一个 禽反 转录病毒群 ，是禽 白血病毒（ Ａ ｖ ｉ ａ ｎ Ｌ ｅ ｕ ｋ ｏ ｓ ｉ ｓ Ｖｉ ｒ ｕ ｓ ， ＡＬ Ｖ） 、 马立克 氏病病毒（ Ｍａ ｒ ｅ ｋ ’ Ｓ ｄ ｉ ｓ ｅ ａ ｓ ｅ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ，ＭＤＶ ） 之 后第三种 引起禽 类发 生肿瘤 的病 毒 ，不仅 感染鸡 ，还可 以感染 火 鸡、鸭 、鹅 、鹌鹑和野鸡 等ｎ １ 。Ｒ Ｅ Ｖ主要诱发鸡 急性 网状 细胞肿瘤、淋 巴组织和其它组织 的慢性 肿瘤等 。
１ ０ ０ ｎ ｇ ／ ｌ ａ １ ） 。
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除肿瘤 ￣ Ｆ Ｒ Ｅ Ｖ还 可导致 感 染禽类 胸 腺 、法 氏囊等 免
疫器官 发生 萎缩 ，形成 免疫抑 制 ，降低 了免疫应 答 ，对 其它病 原体 的敏感 性增 强 ，生产 性能下 降。禽通 常可经 垂 直传 播 、水平传 播 以及经 注射 了被 Ｒ Ｅ Ｖ污 染 的活疫苗 而 感染 ，但很 少 出现 肿瘤 ，多呈 现抗 体阳性 。近 年来 ， 我 国鸡 群 中Ｒ Ｅ Ｖ的血清抗 体 阳性 率逐渐 增 高 ，特 别是 在 地 方 品系鸡 中极 为 明显 （ ・ ，显 示地 方 品 系鸡 中仍 存在 Ｒ Ｅ Ｖ感染 的 巨大 风险 。本研 究 即 从山东 省地 方 晶系寿光 鸡 中分离 鉴定 了２ 株Ｒ Ｅ Ｖ并对其ｅ ｎ ｖ 基 因进行 了测序分析 。