生物硕士毕业答辩4PPT资料24页
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M.DNA marker DL 2 000; 1. BamHⅠ+XhoⅠ digestion products
方法与结果（二）
重组ΔSADPN蛋白的诱导表达及纯化
诱导条件优化
IPTTG/时间/温度 IPTG
重组表达菌
诱导表达
试剂盒 活性鉴定
摇瓶培养 破菌、离心 菌体上清 镍离子 纯目的蛋白 亲和纯化
方法与结果（二）
4、重组ΔSADPN蛋白的纯化
KD M 1 2 3 4 5
97.2 66.4 44.3 29.0 20.1
M..Protein molecule weight Marker;1. Sample of impurification; 2. Elution products with 20 mmol/ L Imidazole;3.Elution products with 50 mmol/ L Imidazole;
组别
主要内容
➢研究背景 ➢目的及意义 ➢实验技术路线 ➢方法与结果 ➢创新与结论
研究背景
脂联素(adiponectin)
脂肪细胞中发现的唯一与肥胖呈负相关性的特异性血浆 蛋白。肥胖、冠心病、Ⅱ型糖尿病患者血浆中的脂联素 低于正常水平。
编码人脂联素的apMI基因定位于染色体3q27上，长度为 16kbp，包含3个外显子和2个内含子 。
方法与结果（一）
2、PCR扩增目的基因(678bp )
bp M 1 2
3、重组质粒酶切鉴定
bp M 1
2 000 1 000
750 500 250 100
M.DNA Marker DL 2000； 1.PCRproduct ; 2.Negative control
2 000 1 000
750 500 250 100
破菌沉淀
阳性对照
检测结果
0.855
0.018
0.637
3、重组ΔSADPN蛋白诱导表达条件的优
化
诱导温度的优化 KD M 1 2 3 4 5 6
97.2 66.4
44.3 29.0
空白对照 0
20.1
M.Protein molecule weight Marker ; 1～3.Supernatant of cell lysates induced at 25℃ 30℃ 37℃ 4～6.Precipitation of cell lysates induced at 25℃ 30℃ 37℃
酶切、连接
目的基因
重组载体
转化
重组百度文库达菌 转化
质粒
碱裂解法
重组克隆菌
酶切鉴定
方法与结果（一）
1. 人脂肪组织总RNA的提取
总RNA浓度= OD260×稀释倍数× 40μg/ml OD280=0.254，OD260=0.485 RNA含量=0.485×1×40=19.4μg/mL 纯度=OD260/OD280=0.485/0.254=1.910
方法与结果（二）
1、重组菌BL21(DE3)/pET41a/ΔSADPN诱导表达(54.5kD )
KD M 1 2 3 4
97.2 66.4
44.3
29.0
20.1
M..Protein molecule weight Marker ; 1. Normal cell lysates control; 2. cell lysates induced at 25℃ for 6 hours;
方法与结果（二）
诱导剂浓度的优化
1 23 4 5 67 8
1～4.Supernatant of cell lysates induced at 25℃ for (0.10/0.05/0.03/0.02) mol/LIPTG 5～8.Precipitation of cell lysates induced at 25℃ for (0.10/0.05/0.03/0.02) mmol/LIPTG
方法与结果（三）
1、检测标准品的制备
测定值（ng/mL)
Mean S CV﹪
18.41 18.24 18.42 17.65 17.45 18.28 18.01 18.16 17.82 18.38 18.10 0.34 1.89
2、标准品稳定性试验
t=1.112，显著性概率（Sig.）P=0.309＞0.05，表明在2～8℃和37℃ 放置144h检测结果没有显著性差异，制备的标准品稳定性较好。
人脂联素由244个氨基酸组成 ，由分泌信号序列、特异 序列、胶原重复序列、球状序列等4个结构域组成，其中 球状区(gADPN)是脂联素生物活性的关键部位。
目的及意义
本研究建立的血浆脂联素酶免定量检测方法——
可作为冠心病、糖尿病的辅助诊断依据，并对疾病发生 进行有效的预警；
可作为评价药物在治疗肥胖、冠心病和糖尿病疾病方面 的效果；
方法与结果（二）
诱导时间的优化
12345 678
1～4.Supernatant of celll lysates induced at 25℃ for (4/6/8/10) hours 5～8.Precipitation of cell lysates induced at 25℃ for (4/6/8/10) hours
进一步研究脂联素作用机制提供方便； 利用基因工程方法制备脂联素定量检测试剂盒中的标准
品，提高了稳定性和生物安全性。
实验技术路线
脂肪组织
目的基因
重组载体
工程菌
目的蛋白
标准品
抗体
建立双抗体夹心ELISA定量检测方法
方法与结果（一）
人脂联素基因去信号肽区的克隆与鉴定
脂肪组织
RT-PCR
pET41a(+)
3. Supernatant of cell lysates induced at 25℃ for 6 hours; 4. Precipitation of cell lysates induced at 25℃ for 6 hours;
方法与结果（二）
2、重组ΔSADPN蛋白活性鉴定
检测样品
破菌上清
4.Elution products with 100 mmol/ L Imidazole;5.Elution products with 200 mmol/ L Imidazole.
方法与结果（三）
双抗体夹心ELISA检测方法的初步建立
纯目的蛋白
定量试剂盒标定
标准品
抗体
建立双抗体夹心ELISA定量检测方法
方法与结果（二）
重组ΔSADPN蛋白的诱导表达及纯化
诱导条件优化
IPTTG/时间/温度 IPTG
重组表达菌
诱导表达
试剂盒 活性鉴定
摇瓶培养 破菌、离心 菌体上清 镍离子 纯目的蛋白 亲和纯化
方法与结果（二）
4、重组ΔSADPN蛋白的纯化
KD M 1 2 3 4 5
97.2 66.4 44.3 29.0 20.1
M..Protein molecule weight Marker;1. Sample of impurification; 2. Elution products with 20 mmol/ L Imidazole;3.Elution products with 50 mmol/ L Imidazole;
组别
主要内容
➢研究背景 ➢目的及意义 ➢实验技术路线 ➢方法与结果 ➢创新与结论
研究背景
脂联素(adiponectin)
脂肪细胞中发现的唯一与肥胖呈负相关性的特异性血浆 蛋白。肥胖、冠心病、Ⅱ型糖尿病患者血浆中的脂联素 低于正常水平。
编码人脂联素的apMI基因定位于染色体3q27上，长度为 16kbp，包含3个外显子和2个内含子 。
方法与结果（一）
2、PCR扩增目的基因(678bp )
bp M 1 2
3、重组质粒酶切鉴定
bp M 1
2 000 1 000
750 500 250 100
M.DNA Marker DL 2000； 1.PCRproduct ; 2.Negative control
2 000 1 000
750 500 250 100
破菌沉淀
阳性对照
检测结果
0.855
0.018
0.637
3、重组ΔSADPN蛋白诱导表达条件的优
化
诱导温度的优化 KD M 1 2 3 4 5 6
97.2 66.4
44.3 29.0
空白对照 0
20.1
M.Protein molecule weight Marker ; 1～3.Supernatant of cell lysates induced at 25℃ 30℃ 37℃ 4～6.Precipitation of cell lysates induced at 25℃ 30℃ 37℃
酶切、连接
目的基因
重组载体
转化
重组百度文库达菌 转化
质粒
碱裂解法
重组克隆菌
酶切鉴定
方法与结果（一）
1. 人脂肪组织总RNA的提取
总RNA浓度= OD260×稀释倍数× 40μg/ml OD280=0.254，OD260=0.485 RNA含量=0.485×1×40=19.4μg/mL 纯度=OD260/OD280=0.485/0.254=1.910
方法与结果（二）
1、重组菌BL21(DE3)/pET41a/ΔSADPN诱导表达(54.5kD )
KD M 1 2 3 4
97.2 66.4
44.3
29.0
20.1
M..Protein molecule weight Marker ; 1. Normal cell lysates control; 2. cell lysates induced at 25℃ for 6 hours;
方法与结果（二）
诱导剂浓度的优化
1 23 4 5 67 8
1～4.Supernatant of cell lysates induced at 25℃ for (0.10/0.05/0.03/0.02) mol/LIPTG 5～8.Precipitation of cell lysates induced at 25℃ for (0.10/0.05/0.03/0.02) mmol/LIPTG
方法与结果（三）
1、检测标准品的制备
测定值（ng/mL)
Mean S CV﹪
18.41 18.24 18.42 17.65 17.45 18.28 18.01 18.16 17.82 18.38 18.10 0.34 1.89
2、标准品稳定性试验
t=1.112，显著性概率（Sig.）P=0.309＞0.05，表明在2～8℃和37℃ 放置144h检测结果没有显著性差异，制备的标准品稳定性较好。
人脂联素由244个氨基酸组成 ，由分泌信号序列、特异 序列、胶原重复序列、球状序列等4个结构域组成，其中 球状区(gADPN)是脂联素生物活性的关键部位。
目的及意义
本研究建立的血浆脂联素酶免定量检测方法——
可作为冠心病、糖尿病的辅助诊断依据，并对疾病发生 进行有效的预警；
可作为评价药物在治疗肥胖、冠心病和糖尿病疾病方面 的效果；
方法与结果（二）
诱导时间的优化
12345 678
1～4.Supernatant of celll lysates induced at 25℃ for (4/6/8/10) hours 5～8.Precipitation of cell lysates induced at 25℃ for (4/6/8/10) hours
进一步研究脂联素作用机制提供方便； 利用基因工程方法制备脂联素定量检测试剂盒中的标准
品，提高了稳定性和生物安全性。
实验技术路线
脂肪组织
目的基因
重组载体
工程菌
目的蛋白
标准品
抗体
建立双抗体夹心ELISA定量检测方法
方法与结果（一）
人脂联素基因去信号肽区的克隆与鉴定
脂肪组织
RT-PCR
pET41a(+)
3. Supernatant of cell lysates induced at 25℃ for 6 hours; 4. Precipitation of cell lysates induced at 25℃ for 6 hours;
方法与结果（二）
2、重组ΔSADPN蛋白活性鉴定
检测样品
破菌上清
4.Elution products with 100 mmol/ L Imidazole;5.Elution products with 200 mmol/ L Imidazole.
方法与结果（三）
双抗体夹心ELISA检测方法的初步建立
纯目的蛋白
定量试剂盒标定
标准品
抗体
建立双抗体夹心ELISA定量检测方法