细菌DNA提取方法

细菌DNA提取方法

细菌dna提取方案

细菌DNA提取方案

细菌DNA提取方案：革兰氏阴性菌，如E.coli，一般有三种可以选择的方法。

一、水煮模板法——主要用于PCR反应

1、接种单菌落于LB或脑心平板，连续画线，37摄氏度培养18－24小时。

2、刮取1～2接种环菌苔加入150微升三蒸水中，混匀，100摄氏度煮沸10分钟。

3、12000转/分钟离心10分钟，取上清，－20摄氏度保存备用。

操作最简便，对试剂条件要求低。缺点是纯度不够高，可能会含有RNA、蛋白等杂质。但是作为一般检测目的的PCR反应模板已经足够了。

有人称扩增4kb以下片段都可用此种方法制取模版，编者用此类模板PCR可以扩增到3500bp的片段。编者建议：此法得到的模版保存时间短，强烈建议每月重新制作一次。

二、CTAB/NaCl 法

1、接种一单菌落于5mlLB中,30℃培养过夜,

2、取1ml种子培养液接入100ml2%LB中,37℃、220r/min培养16小时;

3、5000r/min离心10分钟,弃去上清。

4、加入10mlTE离心洗涤后,用10mlTE溶解菌体,混匀,-20℃保存备用。

5、取3.5ml菌悬液,加入184μl10%SDS,混匀,加入37μl10mg/ml蛋白酶K,混匀,37℃温育1小时

6、加入740μl5mol/LNaCl,再加入512μlCTAB/NaCl,混匀,65℃温育10分钟。

7、加入等体积的氯仿/异戊醇,混匀,10000r/min离心5分钟,保留上清。

8、上清中加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1),混

匀,10000r/min离心5分钟,保留上清。

9、加入0.6倍的异丙醇,混匀,10000r/min离心5分钟,收集DNA沉淀,用70%乙醇离心洗涤DNA沉淀。

10、用1mlTE溶解DNA,加入终浓度为20μg/mlRNaseA,4℃保存。

CTAB/NaCl法提取的DNA纯度较高，蛋白杂质较少，保存时间长，编者更喜欢把终浓度为20μg/ml RnaseA加在第5步温育的时候，这样最后没有RnaseA污染。每一步操作细致一些，得到的DNA可用于Southern blot。编者建议：长时间保存DNA可放于-20℃，但要尽量减少反复冻融，否则影响DNA质量。

细菌dna提取方案

三、盐析法

1、1.5ml对数期菌液

2、12000rpm 30 s

3、200ul裂解液（同CTAB/NaCl法），37c,1hr

4、66ul 5M NaCL,混匀充分，12000rpm 10min

5、上清用粗枪头取至新管

6、等体积酚充分混匀，12000rpm 3min，反复抽提至无蛋白层

7、取水层，等体积氯仿混匀，12000rpm 3min

8、上清至新管，2倍体积预冷无水乙醇

9、-20C，20min，14000rpm，15min

10、400ul 70%冷乙醇洗涤

11、干燥，100ul 20ug/ml RNaseA，37C，30min

12、2倍体积无水乙醇沉淀，70%冷乙醇洗涤

13、干燥，溶于100ul TE

介于方法一和方法二之间，CTAB虽然取出糖分效果较好，但CTAB本身也是有毒的，所以此方法放弃了CTAB。革兰氏阳性菌，由于细胞壁的结构与阴性菌有差别，裂解比阴性菌稍微麻烦一些，可以采取CTAB/NaCl 法稍加修改，在第四步加入终浓度2mg/ml的溶菌酶，37度温育1h。

实验注意：提基因组最好要将枪头尖剪掉（剪掉以后在酒精灯上迅速过一下，使其断口圆滑）。以免枪头损伤基因组！抽干时最好是风干！

细菌基因组DNA的提取方法综述，提供了5种方法。

1 快速微量提取法

A.取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm离心1min, 丢去上清夜，收集菌体。

B.加入400ul裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸

钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）混匀,置于37oC水浴1hr。

C.然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心

15min。

D.取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。

E.加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M ,pH8.0)，-20度保存1小时后，13000rpm离心15min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4℃保存备用。

2 蛋白酶/SDS法制备

细菌dna提取方案

先用10ml含适当抗生素的GBM过夜培养Delftia sp.，第二天4000rpm 离心10min收集菌体，用Washing TE（50mmol/LTris-HCl pH8.0,10mmol/LEDTA pH8.0）洗菌体2次，之后将菌体充分悬浮在5ml 1×TE缓冲液中，先后加入0.5ml 5mg/L的蛋白酶、0.5ml 10% SDS，轻轻混匀后50℃放置3h~5h，接着用等体积的Tris饱和苯酚抽提2次，苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，氯仿抽提一次后，乙醇沉淀DNA，用自动移液器吸管头将絮状DNA沉淀块吸附到Ep管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于适当1×TE或ddH2O中。

3

1) 细菌培养：细菌接种于5ml液体培养基中，37℃摇床（300rpm）培养过液。2) 细菌收集：取1ml培养物于

1.5ml EP管中，室温8000rpm离心5min，弃上清，沉淀重新悬浮于

1ml TE（pH8.0）中（用ddH2O也行)。3) 菌体裂解：加入6μl 50mg/ml

的溶菌酶，37℃作用2h。再加2mol/LNaCl50μl，10%SDS 110μl，20mg/ml 的蛋白酶K 3μl，50℃作用3h或37℃过夜。（此时菌液应为透明粘稠液体）4) 抽提：菌液均分到两个1.5ml EP管，加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶