抗原标记蛋白分离线粒体方法的比较

抗原标记蛋白分离线粒体方法的比较

前言（Abstract）:

线粒体是细胞的“power house”，为提供细胞新陈代谢的能量的细胞器；此外，线粒体有自身的DNA和遗传物质，因基因组数量有限而成为一种具有半自主性的细胞器。因此线粒体的存在对细胞具有重要的意义。时下某些与线粒体有关疾病的发生或发生某种疾病时线粒体的变化，对于研究这类疾病（如癌症等）以及如何治疗这种疾病都有相关的医学价值。随着对线粒体的研究深入，分离得到线粒体的纯度在其本身的研究中愈显重要。迄今，分离线粒体的方法不胜枚举，如电泳，离心等，但分离得到的线粒体的纯度不尽相同。要想得到高纯度度线粒体，能将线粒体从细胞内一个一个“拿”下来是最好不过的。我们的问题在于谁去拿呢？在这种情况下，抗原抗体结合的特异性为我们打开了很好的一扇门。这里所提出的方法基于抗原抗体（Ag-Ab）反应的专一性，可以特异性的相互结合。根据这一原理，如果在线粒体膜上特定的蛋白，用相关的抗原进行标记，在分离的过程中通过相应的抗体则可以将线粒体完全的分离开来，这样就可以分离得到高纯度的线粒体。

主体：

线粒体膜蛋白（The proteins of mitochondrial membrane）:

线粒体是双层膜的细胞器。根据结构与功能的关系，功能越是多的结构其组成越是复杂，主要表现在蛋白质的数量和种类上。线粒体无时无刻不在提供细胞生理活动所需的能量，它对细胞的重要性这边就不再赘述。也就是说线粒体双层膜上含有丰富的蛋白质，如腺苷酸转运蛋白、棕色脂肪组织的解偶联蛋白、异柠檬酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、TOM-22以及D-3羟丁酸脱氢酶等。这篇文章的主要目的在于运用抗原标记抗体识别的技术对几种蛋白标记分离线粒体的方法的比较。

一、TOM-22&Anti-TOM22[2]：

1、TOM-22蛋白是存在于线粒体外膜上转位酶的三个亚单位之一（成分为：TOM40、TOM7、TOM22），在真菌和真核生物的线粒体转位酶内所起到的作用

是益是弊现在还没有个定论。其抗体为Anti-TOM22。

2、分离过程：

Ⅰ. 取样。人或任何真核生物体组织细胞都可以作为线粒体的来源。根据线粒体分布差异，取线粒体较多的组织块。

Ⅱ.组织细胞的溶解:获取不同人细胞系大约融合90%并用PBS洗涤两次，1×10^7在1ml的用冰预冷的PBS溶液中，溶液中含有完备的蛋白抑制混合片剂并被一根针剪切大约20次。考虑到细胞的不同大小，不同直径的针用于细胞的碎裂：26G用于293人胚肾细胞，29G用于Hela细胞，27G用于骨肉瘤细胞的破裂。玻璃匀浆机用于碎裂大量的细胞。取洗涤液一等分溶液，通过锥虫蓝排斥反应来确定80%的细胞已经溶解。[2]

Ⅲ.分离过程：

1、凝胶柱的分离：

将抗体anti-TOM22加到充满凝胶颗粒的层析柱中,取先前的细胞溶解液,分次等量的通过凝胶柱。由于抗原抗体反应的特异性，含有TOM22蛋白的线粒体则、被吸附在凝胶颗粒中，由此将线粒体从混合溶液中分离开来。吸附在凝胶上的线粒体与抗体结合，用PH低于TOM22等电点的盐酸溶液多次清洗凝胶柱，破坏其抗原抗体之间的作用力，使得二者分开，即可得到高纯度的线粒体。

2、超顺磁珠分离（superparamagnetic microbeads）

1）、超顺磁珠：anti-TOM22 microbeads。磁珠是极其小的（直径为50纳米）超磁力微粒物的胶体悬浮液。[2]通过抗原抗体结合在线粒体的外膜上，按照上述方法组织细胞溶解后，将溶解液放在一个强磁场中，根据磁场中的作用力进行分离。

3、方法可行性的分析

一、凝胶柱分离：

凝胶柱分离是一种较为普遍的分离方式，主要利用分子量的大小来进行分离。通过抗原抗体反应加强了凝胶对特定物质的吸附性。经过数次的过滤后，通过改变反应的PH值，即如上所说的用PH低于TOM22的等电点的盐酸清洗凝胶柱，从而破坏其抗原抗体之间的作用力。但这种方法由于分离抗原抗体是其他杂质的引入，使得分离出来的线粒体的纯度受到干扰。

二、超顺磁珠的分离：(MACS)

1）、产出率

为了确定这种方法能够成功的分离出线粒体，取一个人胚肾293报道分子细胞系持续不断的表达EGFP（绿色荧光蛋白）与来自于细胞色素C氧化酶的亚基Ⅷ的前体的线粒体定向序列相互融合，结果可见如图[1]：

Fig. 1. FACS analysis of mitochondria isolated from transfected 293 HEK cells using the MACS protocol. Mitochondria in transfected 293 HEK cells express EGFP fused to a mitochondrial targeting sequence and, therefore, are fluorescently labeled. The green line displays the specific fluorescence of mitochondria, whereas the gray area represents the autofluorescence of mitochondria from untransfected 293 HEK cells. Compared with the crude cell lysate before isolation (A), the mitochondrial fraction (C) shows a significant enrichment of mitochondria, whereas hardly any signal was detectable in the flow-through and wash fractions (B). An overlay of the crude cell lysate and mitochondrial fraction (D) confirms the specific enrichment of mitochondria obtained with the MACS protocol.