种子摇瓶制备操作规程

种子摇瓶制备操作规程

目的：制备酶液用于酶解生产糖液，熟悉摇瓶种子制备工艺

范围：种子斜面、培养皿制备，一级、二级摇瓶种子制备

职责：根据工艺制备合格的摇瓶种子，制得酶液，考察无菌操作。内容：

1 一级种子斜面、培养皿制备

1.1 制备前准备

1.1.1 需用器具与设备与用途

1.1.2 配制培养基清单（按200ml计算）

1.2.3 称量过程中需填写《斜面种子配制与灭菌记录》。

1.2.4 物料批号与厂家根据实际情况调整后做好记录。

1.2 培养基配制

1.2.1 量取50ml纯化水倒入500ml烧杯中，放入水浴锅中加热到50℃。

1.2.2 加热少许酶粉，搅拌均匀，加入按配料清单称量好的魔芋粉，在50℃搅拌5分钟后

将烧杯拿出水浴锅。

1.2.3 将需称量物料按百分比放大10倍称量。称取0.3g磷酸二氢钾，定容配置为100ml

溶液，充分溶解后用10ml移液管量取20ml溶液加入500ml烧杯中。

1.2.4 除琼脂粉外，按配料单将称量好的原料倒入烧杯溶解。称量时一人称量一人复核，

认真核实产品名称、数量和厂家。

1.2.5 溶解过程应当缓慢倒入，充分溶解，特别注意酵母浸粉和蛋白胨的溶解，粉末较细，尽量不要结团成球。溶解完毕后测量PH并记录。

1.2.6 溶解完毕后打开电炉，将配置好的培养基溶液放在电炉上加热至沸腾，缓慢倒入琼

脂粉，并均匀搅拌，确保充分溶解，防止结团成球。

1.2.7 量筒量取130ml水加入烧杯中，用试纸测大概PH，迅速量取6或8ml，分别装入12

支试管中，盖上试管塞，等待灭菌。

1.2.8 将剩余料倒入锥形瓶中，盖上瓶塞等待灭菌。

1.3 培养基灭菌

1.3.1 将装有琼脂液锥形瓶、12支装琼脂试管、6个包裹好的空白培养皿放入灭菌锅内。1.3.2 检查锅内液位，盖上灭菌锅盖，插上电源开始升温。

1.3.3 升温到灭菌锅内冷空气排尽，开始有热蒸汽冒出后关闭灭菌锅上两排气阀。

1.3.4 当压力上升到0.11MPa，温度121℃时开始计时，保温20分钟。

1.3.5 保温完毕后用镊子缓慢打开灭菌锅两排气阀，自然排气降温。

1.3.6 冷却后取出锅内物品，放入传递窗，打开紫外灯照射5min后关闭紫外灯，准备传入洁净间进行接种。

1.3.7 填写《斜面种子配制与灭菌记录》。

1.4 接种前准备

1.4.1 打开微生物检查洁净间空调，打开超净工作台电源，调节风量风净工作台。

1.4.2 检查超净台上必备的酒精灯、打火机、接种针、酒精棉、镊子、试管架、斜面架。1.4.3 从细胞库冷冻冰箱取出一支甘油冷冻管，填写相关记录。冷冻管需冰冻保存。进入

洁净区域前将冷冻管管放入传递窗待用。

1.4.4 按洁净区域更衣程序进入洁净区域，穿戴好洁净服，带口罩，带一次性手套。

1.4.5 用酒精棉擦拭超净台，点燃酒精灯，观察火焰情况，调整风量。

1.4.6 将传递窗内的物品拿到超净台内，用酒精棉擦拭接口处。

1.4.7 将试管斜铺放置子斜面架上，保证斜坡末端在试管2/3处。

1.4.8 火焰保护下将锥形瓶中的培养基倒入培养皿中，液体盖住培养皿表面即可。操作时1.4.9 等待培养基冷却固化，取6支用于后续无菌考察。

1.5 接种

1.5.1 用酒精灯外焰灼烧接种针，铁丝部分需烧红，后面手持部分灭到高于进试管区域。

1.5.2 在火焰保护作用下打开冷冻管，放于距离火焰5-10厘米处。

1.5.3 在火焰保护下用夹子打开斜面，用灭菌后的接种针取约一滴种子液接入斜面。

1.5.4 接入时采用划线方式，S型在斜面上划线。

1.5.5 划线完毕后将试管塞在火焰保护下盖上，同时用火焰灼烧接种针灭菌。

1.5.6 按以上操作重复将6支斜面接种，按顺序编号并写上日期和批号接种人

1.5.7 按相同操作火焰保护下打开培养皿上盖，开度约30°角。用沾有种子的接种针在培养皿上划线，划线方式为以1/4圆面为基准，选一面划4条后顺时针在邻近的1/4圆面将原有的条线上划开4条线将菌分散，然后再瞬时针在邻近的1/4圆面上划4条线。

1.5.8 划线完毕后盖上培养皿，将培养皿倒扣。重复上述操作接种4个培养皿。按顺序编号并写上日期和批号接种人，划线时不能划破培养基。

1.5.9 熄灭酒精灯，清理桌面。将接种后的斜面和培养皿放入传递窗。

1.5.10 接种完毕后填写《种子接种培养记录》。

1.6 一级种子斜面（培养皿）培养

1.6.1 将接种和空白培养皿、斜面放置在恒温培养箱内。

1.6.2 设置培养箱温度32℃。培养时间根据菌落情况确定

1.6.3 菌落选择单独的，没连成一片，便于观察的，单菌落直径在1.5-2mm，边缘光滑呈乳白色的。

1.6.4 菌龄达到22h,菌落成形，无杂菌正常后准备转接种或移种。

1.6.5 培养过程中需填写《种子接种培养记录》，记录过程温度和转种时间，无菌情况，培养周期。

2 一级种子摇瓶制备

2.1 制备前准备

2.1.1 需用器具与设备与用途

2.2.3 称量过程中需填写《一级种子配制与灭菌记录》。

2.2.4 物料批号与厂家根据实际情况调整后做好记录。

2.2 培养基配制

2.2.1 操作参见1.2.1-1.2.5节，除麸皮粉外将所有物料溶解。

2.2.2 单独称量麸皮粉，平均分为3等份后分别倒入100ml锥形瓶中。

2.2.3 用量筒分别量取30ml培养基溶液倒入锥形瓶中，摇匀，盖好瓶塞。

2.2.4 用纱布包住锥形瓶口，准备灭菌

2.3培养基灭菌、接种前准备

2.3.1灭菌方式、接种前准备可参见一级斜面（培养皿）操作过程。

2.3.2 进超净台物品包括空白培养皿2个，100ml锥形瓶3个，一级种子斜面培养皿，其

它接种必备物品。

2.3.3 灭菌完成后填写《一级种子配制与灭菌记录》，记录灭菌温度时间。

2.4 一级种子摇瓶接种

2.4.1 在超净台下选择合适的单菌落用于接种。将接种的培养皿或斜面放置距火焰5cm。

2.4.2 火焰接种保护下打开锥形瓶瓶塞，将需要接种的单菌落接入锥形瓶的液体培养基中，注意接入前将接种针在空白面上冷却。

2.4.3 接入后搅拌接种针，同时注意不要碰到瓶口，抽出接种针后盖上瓶塞。

2.4.4 将接种针接入空白培养斜面上，用做无菌对照参考。