蛋白质结合率的测定方法

1.平衡透析法：
优点：简单、经济、受实验因素干扰小等 缺点： 1)透析平衡时间较长。 2)血浆和缓冲液的pH值以及离子强度必 须严格控制。 3)受稀释作用、Gibbs—Donn舳效应以 及体积迁移效应的影响。 4)非特异性的透析设备表面的药物吸附 效应。
2.超滤法：
超滤法利用半透膜原理。为 解决超滤过程中非特异性超滤装 置表面的药物吸附问题．在测定 皮质激素与血浆蛋白结合的过程 中。Taylor等51对传统超滤法进 行了改进，解决了可溶性差以及 药物的吸附问题，使方法特别适 合于先导化合物的优化。
总之，测定药物血浆蛋白结合率的方法还有 很多，如超速离心法，该法对药物的吸收较 少，主要受药物沉积作用的影响；凝胶过滤 法，该法省时快速，可适用于高分子量的药 物；此外，色谱法，质谱法，圆二色谱法以 及多种检测方法联用技术在测定血浆蛋白结 合研究中有很广阔的发展前景。近年来，随 着高通量药代筛选技术的迅猛发展，这种高 效、高速的新技术也应用到血浆蛋白结合率 的测定研究中。
5.高效前沿分析法(HPFA)：
优点：1)样品预处理简单，允许直接进样，可以连接到 在线的高效液相色谱或毛细管电泳系统中进行自动分 析。2)所采用的流动相是模拟人体生理环境的磷酸盐缓 冲液，属于水性介质。3)当药物峰与蛋白峰完全分离时， 可同时从药物平台峰的峰面积和峰高计算出总药物浓 度和游离药物浓度。4)串联一个手性高效液相色谱法 (HPLc)柱，或与毛细管电泳手性拆分技术相结合，可分 别得到外消旋体中两个对映体的平台峰，求得蛋白结 合参数。5)具有调节效应相当于药物的富集，大大提高 了样品的检测限，可用于药物蛋白结合率很高、游离 药物浓度极低的药物研究。6)可以分析纳摩尔级的样品， 或进行纳升量样品的测定。HPFA对于分析药物与缺乏 的或较难获得的蛋白质的结合研究是非常有利的。
5.高效前沿分析法(HPFA)：
HPFA以分子排阻原理为基础，是近几年发展起来的一种 能够同时测定药物与蛋白结合平衡中游离药物和总药物浓度 的一种新的色谱方法。HPFA能够避免高效亲和液相色谱(HPAc) 存在的问题，在当今药物蛋白结合的研究中，已成为一种很 有发展前景的技术。特别是采用集高速高效及高选择性优点 于一身的HPcE进行前沿分析可以满足微量样品的测定，这种 方法称为HPCE／FA，是最具活力的分析技术之一。 HPFA不仅可以用来分析药物与蛋白之间的相互作用，而且可 用来研究存在着快速和可逆平衡的任何物质之间的相互作用， 特别是为内源性活性物质的研究提供了快速、准确的分析方 法，因此在药代动力学研究中将具有广阔的应用前景。
2.超滤法：
优点：设备简单、操作方便、不受稀 释效应和体积迁移的影响。其最大优 点是实现血浆中游离药物的快速分离， 仅十几分钟至数十分钟即可收集到足 够供测定的血浆超滤液，加之与高灵 敏度的液质联用检测技术相结合，超 滤法已广泛用于大规模生物样品的游 离药物浓度测定。 缺点：1)分离过程中结合平衡不稳定。 2)对高蛋白结合率药物的游离浓度难 以准确检测。3)结合药物在透过滤膜 时会出现泄漏。4)超滤装置对药物具 有吸附性。
蛋白结合率的测定方法
1.平衡透析法：
平衡透析法基于药物结合的平衡原理， 是测定药物游离浓度最常用的方法。同时 也是研究药物血浆蛋白结合率的经典方法。 为了缩短检测时间，提高样品分析的通量， 目前采用96孔平衡透析装置进行血浆蛋白 结合率的测定。该装置的独特设计使表面 积／体积达到最大化、测定方法自动化， 能够减少非特异性的透析设备表面的药物 吸附，并且能够加速待测样品的溶解，缩 短平衡时间。
3.微透析法：
微透析法是近年来发展起来的直接 测定体内血浆、组织和其他生理体液中 药物游离浓度的测定方法。具体操作如 下：将一个含透析膜的微透析探针用外 科法植于血管或组织间隙，透析缓冲液 经探针泵入，血液中或组织液中的游离 药物通过浓度梯度扩散经透析膜进入探 针，透析液收集一段时间后便可分析测 定其中药物的游离浓度。近年来，微透 析与高效液相色谱毛细管电泳或质谱等 分析仪器联用在生命过程动态变化的研 究中显示出很好的发展前景。
4.高效亲和色谱法 (HPAC)：
HPAC被用于分析药物与血浆 蛋白的结合，可由药物的电泳迁移 率的连续变化计算出药物与蛋白的 结合常数。该方法允许多种药物同 时进样，并可同时测定多种药物与 蛋白的结合常数，这对立体选择性 蛋白结合的研究非常有用。药物在 蛋白上的结合位点可采用已知结合 位点的置换剂来鉴别。采用HPAC测 定苯妥英与人血清蛋白的结合，阐 明了苯妥英与其他药物竞争血浆蛋 白结合位色谱法 (HPAC)：
优点是：1)固定化的生物高聚物具有 良好的稳定性和恒定的结合行为。2) 色谱系统良好的精密度和重现性可提 供大量结合作用的对比研究，特别适 宜对映体的选择性研究。 缺点是：1)流动缓冲液中蛋白的强紫 外吸收可干扰药物的检测。2)光学异 构体之间的结合位点数可能不同。3) 有时检测到的峰形展宽，可能导致结 合常数的估计错误。4)药物与蛋白的 结合会发生在毛细管内表面，致使数 据分析复杂化。5)迁移率变化的重现 性差。
3.微透析法：
优点：是可以在基本不干扰生物体内 正常生命活动的情况下进行实时采样 和在线分析，可连续研究在生理条件 下体内药物与蛋白的结合作用。 缺点：1)只可测定药物的游离浓度， 得不到总浓度或结合药物浓度的信息。 2)受探针性能的影响，药物的回收率 也受到限制，特别是蛋白结合率很高 的疏水性药物，回收率较低的问题很 严重。3)缺少足够灵敏的分析方法。