细胞衰老与细胞凋亡的研究综述

细胞的衰老与细胞凋亡研究的综述

2009级生物科学平昊

摘要：在细胞成熟与行使功能后，即走向衰老，细胞总体的衰老导致个体的老化细胞衰老有诸多因素调控当前多集中于分子水平上的研究，如探索衰老相关基因，癌基因抑或抑癌基因等癌肿相关基因与细胞衰老的关系，染色体端粒与衰老的关系，以及一些与疾病有关的无知在衰老中的作用。

细胞终末分化与衰老最终导致细胞死亡，细胞死亡有两种类型：细胞程序性死亡和细胞坏死。前者又称细胞凋亡，多年来的研究表明细胞凋亡与个体生长、发育以及疾病发生与防治有着密切的关系，所以找出细胞凋亡的关键调控基因及其作用机制将是研究细胞死亡的重点工作。

关键词：衰老凋亡研究方法检测方法

1.细胞凋亡的主要检测方法研究进展

1.1 简介

细胞凋亡是由基因调控的细胞主动性死亡过程。细胞凋亡的特征是具有明显的形态学改变,包括细胞膜发泡,细胞皱缩,线粒体膜电位下降,染色体凝聚和DNA片段化等。近年研究表明,细胞凋亡在疾病的发生、发展中起着非常重要的作用。研究表明,机体内细胞凋亡是受多基因精细调控的结果,过量或者过少的细胞凋亡均对机体有害。人类及动物的多种疾病的发生发展均与细胞凋亡密切相关,如果能恰当的阻断或加速细胞凋亡,可以为治疗或防控凋亡相关疾病提供新的治疗途径。细胞凋亡的检测是开展凋亡研究的必需步骤,凋亡的所有检测方法是基于凋亡细胞所特有的形态学和生物化学特征建立的。

1.2主要检测方法

1.2.1 细胞凋亡的形态学检测

细胞发生凋亡时具有固有的形态特征,如细胞核表现缩小、染色质边缘化、凝集,凋亡晚期还会出现由核碎片与胞质内的部分细胞器混合在一起,且被细胞膜包裹形成的凋亡小体。DNA特异性染料(如Hoechst33342、Hoechst33258和DAPI 等)可以与DNA的A-T碱基区进行非嵌入式结合,从而使细胞核着色,在紫外光激发时会出现明显的荧光。通过荧光显微镜或激光共聚焦显微镜可以观察细胞染色质的形态学变化、膜结构及通透性的改变,从而鉴别凋亡细胞、正常细胞及坏死细胞。细胞凋亡的形态学检测结果直观,至今仍是判定细胞是否发生凋亡的金标准,但观察凋亡细胞的形态特征耗时费力,不适于大量凋亡样本的检测。

1.2.2 细胞凋亡的DNA片段化检测

DNA ladder

提取凋亡细胞的基因组DNA,经电泳后染色观察可见180 bp~200 bp及其不同倍数的弥散状DNA条带,即DNA ladder。DNA ladder被视为经典的检测细胞凋亡的指标,但DNA凝胶泳特异性虽高而灵敏度偏低,不适于检测细胞凋亡初期DNA链的轻微损伤。

TUNEL检测法

TUNEL法是一种将分子生物学和免疫组织化学相结合的原位检测凋亡细胞DNA片段的方法。其基本原理为:细胞发生凋亡时核酸内切酶被激活,染色质或DNA被核酸内切酶切割后产生180 bp~200 bp的含3′-OH末端的片断,脱氧核苷酸末端转移酶将结合有荧光素的核苷酸(dUTP)标记到缺口3′-OH的末端,依次加入HRP抗荧光素抗体和HRP显色底物DAB,凋亡细胞显色明显,而正常细胞没有DNA断裂或者只有少量的DNA发生断裂,故不被显色。

1.2.3 ELISA检测法

应用ELISA方法也可以检测DNA片段化,在凋亡的早期DNA发生断裂,核小体释放进入细胞质中,核小体是染色质的基本单元,通过ELISA检测凋亡细胞释放到细胞质中的核小体从而确定细胞凋亡程度。此方法既可定性又可以定量,而且适合检测大批量样本,不需要特殊的仪器。试验过程中如果裂解细胞的时间过长可能导致细胞核中的DNA片段也被计算在内,进而导致结果偏高,因此不同的细胞系需要经过数次摸索才能确定最佳检测条件。

1.2.4 细胞凋亡的线粒体膜电位的检测

细胞发生凋亡过程中,线粒体也会发生变化。线粒体通透性转换孔的开放导致的线粒体膜通透性发生变化,此被认为是线粒体导致细胞死亡的众多途径中关键的一个。研究证实细胞在凋亡刺激信号的刺激下线粒体膜电位发生下降,线粒体膜电位的降低是细胞凋亡的早期事件,而且细胞聚集染料能力的下降可以用来反映膜电位的下降程度,进而通过流式细胞术检测线粒体内跨膜电位的变化。

1.2.5 细胞凋亡相关的基因检测

凋亡促进基因表达的检测

caspases家族基因表达产物是促进细胞发生凋亡的主要酶类,细胞凋亡机制的执行基本都是由一个进化上保守的caspase完成的。在凋亡中根据其作用及扮演的角色不同,caspase可以分为2类,启动caspase和执行caspase。执行caspase是被启动caspase激活后,执行caspase经过一系列的酶激活级联反应,导致最后细胞凋亡。不同的细胞系与不同的凋亡刺激因素

会引起不同种类的caspases活化。因此,不同的细胞凋亡,也需要选取不同的caspase来检测,最终确定凋亡促进基因的表达情况。

凋亡抑制基因表达的检测

通常在检测细胞凋亡试验中,除检测凋亡促进基因的表达外,还会同时检测抑制凋亡基因的表达情况来反映细胞凋亡,如核因子-κB(NF-κB),环氧合酶(COX)和BCL-2家族成员等基因。用RT-PCR检测促凋亡基因p53、Bax和Caspase-3和抑制凋亡基因Bcl2和Bcl-XL的表达,进而确定了胡萝卜提取物对人类癌细胞增殖和凋亡的影响。

1.2.6 细胞周期的测定

鉴于细胞凋亡后发生DNA断裂,根据此特征应用DNA结合染料,如碘化丙啶(Propidium iodide, PI)、吖啶橙(Acridineorange, AO),或Hoechst dyes等进行细胞周期的检测,判定细胞凋亡的程度和比率。由于DNA小片段溢出的程度受反应时间、温度等影响,需要通过调整凋亡细胞的DNA含量,减少凋亡细胞与非凋亡细胞的重叠峰,进而增加试验结果的可靠性.

Annexin V/PI双染法测定

Annexin V/PI法是根据细胞凋亡早期细胞膜的磷脂对称性发生改变,磷脂酰丝氨酸(PS)由细胞膜内移位到细胞膜外,采用Annexin V/PI双染,并通过流式细胞术测定细胞凋亡的方法。

1.2.7 细胞凋亡的Ca2+浓度变化的测定

Ca2+是细胞中一种十分重要的第二信使分子,细胞众多的生命活动都有Ca2+的参与。关于Ca2+在细胞凋亡中的精确作用还存在很多的争议,但目前的一致结论是:内质网Ca2+丢失会引发内质网压力途径的细胞凋亡发生,压力诱发的Ca2+过多负载会导致更多的坏死,调节性Ca2+浓度的增加在内源性细胞凋亡途径中提供了重要的信号事件.

1.3 结语

细胞凋亡的检测方法都是基于细胞凋亡过程中的各种特征设计的,在进行细胞凋亡检测的时候,要综合几种方法进行检测,因为目前没有一种细胞凋亡的检测方法是完美的,任何一种方法都是有局限性的。不同时间检测细胞凋亡得到的结果也不一样。因此,要想捕捉到明显的细胞凋亡,就要设置不同条件进行检测,比如刺激时间梯度和刺激源浓度梯度等。另外,针对不同时期的细胞凋亡情况的检测,要选择不同的检测方法,比如要测定细胞早期凋亡,就要选择Annexin V/PI法,线粒体膜电位的测定等;而形态学检测,如DNA ladder、TUNEL等检测方法主要是针对细胞中晚期凋亡。因此,只有几种不同的检测方法进行综合检测得到的结果,才能真正的反映细胞发生凋亡的情况,进而准确的对其凋亡进行定性和定量判定。相信伴随着人类对凋亡机制的深入了解,操作简单、敏感性高、成本低廉的细胞凋亡检测方法会越来越多。

2.细胞衰老与细胞自噬的生物学关联

2.1 简介

衰老(senescence, aging) 是生物体必经之途，是生命的表现形式，亦是生物界普遍规律。细胞作为生物体结构和功能的基本单位，其衰老体现着生命的进程。细胞衰老(cellular senescence) 是指细胞生理功能的衰减，包括增殖能力下降、细胞周期停滞、对促凋亡应激原不敏感、衰老相关基因和蛋白表达增加，并伴有形态学的衰老改变，且渐趋于死亡的现象。简言之，至少有两种类型的衰老遏制了细胞增殖，即复制性衰老(replicative senescence,RS) 和应激诱导的衰老(stress-induced senescence,SIS)。前者归因于端粒DNA 的缩短；后者则由不同应激原引起，譬如DNA 损伤、染色质破坏、氧化应激损伤、癌基因激活等。细胞衰老所致的细胞增殖受阻且使其处于极其稳定的细胞周期停滞状态也可视为正常细胞的必死性和肿瘤细胞的永生化之间基本特征的差异。

自噬(autophagy) 则属于依赖溶酶体的细胞分解代谢过程，能降解受损蛋白质、衰老或损伤的细胞器等细胞结构，可被不同应激原所触发。因发现溶酶体而获得1974 年度诺贝尔生理学或医学奖的比利时学者Christian de Duve 在20 世纪50 年代通过电镜观察到自噬体(autophagosome) 结构，并且在1963 年溶酶体国际会议(Ciba Foundation Symposium on Lysosomes) 上首次提出了“自噬”的概念。自噬是最近鉴别的新的衰老相关机制，在衰老进程中，细胞自噬作用呈下调趋势，不同因素诱导的自噬作用增强是多种真核生物寿命延长所必需的，是

衰老相关的极其重要的调节机制。在细胞受多种应激后不同效应上有着不同的影响：例如对代谢废物循环、细胞存活和蛋白质表达等的调节作用。

2.2 细胞自噬与细胞衰老

自噬是细胞内一种“自食(self-eating)”现象，细胞凋亡属“自杀(self-killing)”现象，细胞坏死则属于“他杀(homicide)”现象。自噬与凋亡可有相同的刺激因素和调节蛋白，但触发阈值和方式有别，如何转换和协调目前未知。自噬受多基因调控且具进化保守性，以在细胞质中形成双层膜结构的囊泡为典型特征，该囊泡即自噬体，它包裹了部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等，并与内涵体(endosome) 形成所谓的自噬内涵体(amphisomes)，最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体(autophagolysosome)，降解其所包裹的内容物，以实现细胞的物质和能量的稳态以及细胞器的更新，自噬在细胞蛋白质和细胞器质量控制中起着基础性作用。对于自噬体膜结构的来源，最新研究认为，其主要是由内质网和高尔基体重新组装而成[2]。此外，自噬还在对不同病原体所产生的先天性、适应性免疫应答中起作用[3]。再者，自噬在代谢毒性或其他细胞毒性因素作用下可被上调。然而，自噬在细胞对应激原的应答中的确切作用尚未明了。最新研究结果将自噬与另一个重要的应激反应联系了起来，即细胞衰老。两者在功能上的联系是有限的，即使它们似乎共同被包含于一些概念性特征：两者均可与细胞凋亡作为交变性的生存表型，并且两者同属病理生理学概念。

细胞衰老一术语最早是描述人二倍体成纤维细胞(human diploid fibroblasts, HDFs) 在培养中由于复制能力衰竭导致的细胞周期的“不可逆”停滞状态，与之形成鲜明对比的是“快速可逆性”静止状态。此“复制能力衰竭”归因于端粒缩短所至的界限( 即Hayflick 界限)，后者触发了持续性的DNA 损伤效应和基因组的不稳定性。尽管单一的决定性的细胞衰老标志仍未发现，但是近年来通过体内细胞衰老的研究逐渐发现了一些可靠的标志。例如p53、p16 或Rb，这些肿瘤抑制因子调节途径蕴含于衰老进程，已被广泛认可，但衰老的确切的调节机制仍未阐明。

在特定的环境中，自噬作为“双刃剑”同样也可变为细胞死亡机制( 即II 型细胞死亡，细胞凋亡属I 型细胞死亡)，尽管自噬引起的细胞死亡和存活的双重效应是可被调和的，但尚存争议。然而，通过对不同实验模型的全面研究证实：细胞凋亡和自噬间存在功能性的联系。

2.3 细胞自噬和细胞衰老的分泌表型

衰老细胞能够分泌大量蛋白质，已是不争的事实。其中囊括了可作为细胞衰老标志物的金属蛋白酶(metalloprotease) 和纤溶酶原激活物抑制物

-1(plasminogen activator inhibitor-1)。除了细胞微环境的影响，近年来一系列极具潜力的研究显示：分泌性蛋白可通过自分泌和旁分泌两种方式强化衰老进程，初步确立了细胞衰老相关的分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,

SASP)，并可作为新的细胞衰老效应机理。IL-6 和IL-8是SASP 的主要组分，它们分别是病理学中所熟知的致炎细胞因子和趋化因子。

2.4 细胞衰老与细胞自噬的生物学关联

关于衰老的经典观点认为衰老是由细胞中功能受损的大分子、自由基等细胞内外环境的有害因素积累所致，尤其是在永久性细胞(permanent cells)中，如神经细胞、骨骼肌和心肌细胞。机体衰老中自噬活性衰减的观点现已逐步被认可，并且功能损伤的生物大分子和细胞器的积累在年龄相关症状中有重要作用。再者，在不同物种中延长寿命的实验条件与自噬的激活呈现一致性。奥地利学者Eisenberg等发现，亚精胺(spermidine)作为人类精液的主要组分，能有效地抑制衰老小鼠体内的氧化应激反应。在衰老的酵母菌内，亚精胺可通过抑制组蛋白酰基转移酶(HAT) 活性而触发组蛋白H3 的渐进性脱乙酰基作用，进而避免了氧化应激和细胞坏死的发生。

对于自噬活性的年龄相关性代谢变化，已在大鼠肝脏有过很多研究。然而，细胞毒性应激敏感的自噬作为其急性形式是否在衰老动物中也有衰减，尚未明晰。事实上，Gamerdinger等[4]的研究中发现，BAG3 介导的自噬活性出现在老年小鼠的神经细胞而非星形胶质细胞中，这与HDFs 的复制性衰老相似。因此，应激敏感的自噬在老年动物至少是一些细胞或组织类型中的发生机制可能是完整的。考虑到干细胞衰老和机体衰老间的功能联系，在干/ 祖细胞区域观测应激诱导的年龄依赖性自噬发生能力或将有重要意义。自噬和被称为“死亡之吻”的泛素蛋白酶系统是真核细胞主要的蛋白质降解通道，细胞自噬长期以来被视作一种随机的细胞质降解体系，但是泛素作为一种选择性细胞自噬的特异性因子的观点逐渐被认可。最近的研究也表明：在蛋白酶体介导降解作用与选择性细胞自噬之间，存在着密切的关联。

2.5结语

不同的触发因素，譬如代谢性或遗传毒性应激原，均可诱导细胞自噬，然而自噬对细胞及其微环境的影响则随细胞和微环境的条件改变而变化。细胞自噬与细胞衰老间的生物学关联为阐明衰老机制提供了崭新的研究层面。细胞毒性应激诱导的大量蛋白质降解能促进细胞完整性的维持，这也改变了细胞的命运，从而避免其走向凋亡或衰老。同样地，通过对等地激活蛋白质的合成调节，自噬可以在细胞动态衰老相中影响其蛋白质表达谱。但是，尤其是在衰老背景下，细胞自噬如何被诱导，何时被启动，哪些细胞被涉及，如何诱导适度自噬，如何寻找自噬可控性的核心调节途径等问题都亟待深入研究。