蛋白质的提取与分离分离
提蛋白质的原理及步骤
蛋白质提取是一项基础实验，通常用于从组织或细胞中提取纯度较高的蛋白质样品，以便进行各种蛋白质研究。
常规的蛋白质提取步骤包括以下几个主要步骤：
1. 细胞或组织的裂解：将待提取的样品裂解以释放出蛋白质。
裂解方法取决于被裂解的细胞类型，可使用机械法、化学法、超声波或高压等方法进行裂解。
2. 蛋白质的分离：将蛋白质与非蛋白质组分进行分离，常用的方法有沉淀、过滤、离心和柱层析等。
3. 蛋白质的纯化：通过进一步的分离和纯化来获得高纯度的蛋白质。
这些步骤通常需要进行多次，每次都使用不同的方法来分离和纯化蛋白质。
提蛋白质的原理是基于蛋白质的化学和物理特性进行分离和纯化。
蛋白质分子量大小、电荷、亲水性等特性不同，容易与不同化学试剂、柱层析介质或生物酶相互作用。
通过调节这些条件和步骤，就可以使不同的蛋白质与其它组分分离出来，并得到纯度较高的蛋白质样品。
虽然蛋白质提取步骤较多，但因为各种蛋白质的特性不同，所以实验时需要根据需要选择不同的提取和分离方法以获得更理想的效果。
《蛋白质的提取和分离》 讲义
《蛋白质的提取和分离》讲义一、蛋白质提取和分离的重要性蛋白质是生命活动的主要承担者，在生物体中发挥着极其重要的作用。
从生物体内提取和分离出特定的蛋白质，对于深入研究蛋白质的结构、功能、相互作用以及疾病的诊断和治疗等方面都具有至关重要的意义。
例如，通过提取和分离某种疾病相关的蛋白质，可以为疾病的诊断提供特异性的标志物；对特定蛋白质进行分离和纯化，有助于研究其作用机制，为新药的研发提供靶点。
二、蛋白质提取的原理和方法（一）原理蛋白质的提取基于其溶解性、电荷、分子量等性质的差异。
不同的蛋白质在不同的条件下（如 pH 值、盐浓度、温度等）溶解度不同，利用这一特性可以将目标蛋白质从复杂的混合物中分离出来。
（二）方法1、机械破碎法这包括使用匀浆器、研钵等工具将细胞破碎，使细胞内的蛋白质释放出来。
2、化学渗透法使用一些化学试剂（如表面活性剂、有机溶剂等）破坏细胞膜的结构，从而使蛋白质得以释放。
3、酶解法利用特定的酶（如溶菌酶等）分解细胞壁，达到破碎细胞的目的。
三、蛋白质分离的原理和技术（一）原理蛋白质分离主要依据其物理化学性质的差异，如分子大小、电荷、亲水性等。
（二）技术1、离心技术通过离心机产生的离心力，使不同分子量的蛋白质在溶液中分层沉淀，从而实现分离。
2、凝胶过滤层析利用多孔凝胶作为固定相，根据蛋白质分子大小进行分离。
大分子蛋白质无法进入凝胶颗粒内部，先被洗脱出来；小分子蛋白质则能进入凝胶颗粒内部，后被洗脱出来。
3、离子交换层析基于蛋白质所带电荷的不同进行分离。
离子交换剂带有固定的电荷基团，能与带相反电荷的蛋白质结合。
通过改变溶液的离子强度和 pH 值，可以将结合的蛋白质洗脱下来。
4、亲和层析利用蛋白质与特定配体之间的特异性亲和力进行分离。
将配体固定在层析柱上，含有目标蛋白质的混合物通过层析柱时，目标蛋白质与配体结合而被保留，其他蛋白质则被洗脱，然后通过改变条件将目标蛋白质洗脱下来。
四、蛋白质提取和分离的实验步骤（一）材料的准备选择合适的生物材料，如细胞、组织或生物体。
蛋白质的提取与分离
蛋白质提取与制备具体操作方法1、原料的选择早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。
但至目前经常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料，因而对提取要求更复杂一些。
原料的选择主要依据实验目的定。
从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成本低的原料。
尽量要新鲜原料。
但有时这几方面不同时具备。
含量丰富但来源困难，或含量来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。
一般要注意种属的关系，如鲣的心肌细胞色素C较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。
要事前调查制备的难易情况。
若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。
如利用胰蛋白酶水解蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。
但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属必须一定。
研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。
可能时尽量用全年均可采到的原料。
对动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。
2、前处理a、细胞的破碎材料选定通常要进行处理。
要剔除结缔组织及脂肪组织。
如不能立即进行实验，则应冷冻保存。
除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。
不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难易不一，使用方法也不完全相同。
如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。
⑴机械方法主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。
常用器械有：①高速组织捣碎机（转速可达10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间隔只有十分之几毫米，对细胞破碎程度较高速捣碎机高，机械切力对分子破坏较小。
蛋白质提取的方法和原理
蛋白质提取的方法和原理蛋白质提取是生物化学研究中一项非常重要的工作，它是通过化学或物理方法将目标蛋白质从混合物中提取出来，并获得纯度较高的蛋白样品。
蛋白质提取的方法和原理可以根据不同的需求和样本特点而有所区别，下面我将从样品处理、细胞破碎、蛋白质分离、纯化等方面详细介绍蛋白质提取的常用方法和原理。
一、样品处理样品的类型有很多，包括动物组织、细胞、血液等，每种样品的提取方法都有一定差异。
一般来说，细胞或组织样本在提取之前需要冷冻保存，并进行快速破碎以避免蛋白质降解。
对于血液样本，需要血样离心分离血浆或红细胞，再进行提取。
二、细胞破碎细胞破碎是蛋白质提取的关键步骤，目的是破坏细胞膜和细胞器，并释放蛋白质。
常见的细胞破碎方法有机械破碎、超声波破碎和化学法。
1. 机械破碎机械破碎是最常用的细胞破碎方法之一，可以通过碾磨、研磨、切割等方式破坏细胞。
例如，将样品置于液氮中冷冻后，使用研钵和研杵进行研磨，将细胞研磨成粉末状。
2. 超声波破碎超声波破碎是利用高频高能量的超声波震荡来破碎细胞，通常是在冷冻样品和显微量水中进行。
超声波的震荡可以高效破坏细胞和细胞器，并释放蛋白质。
3. 化学法化学法通常是通过加入化学试剂来破坏细胞。
例如，使用洗涤剂（如SDS、Triton X-100）可以溶解细胞膜，释放细胞内的蛋白质。
三、蛋白质分离蛋白质提取后，需要对蛋白质进行分离，去除杂质和其他成分。
1. 离心离心是最常用的蛋白质分离方法之一，通过不同速度的离心来分离蛋白质。
一般来说，较重的细胞碎片、细胞器和沉淀物会沉积在离心管的底部，而较轻的蛋白质上清液则在上方。
2. 电泳电泳是利用电场将带电蛋白质分离的技术。
常见的电泳方法有SDS-PAGE和凝胶过滤层析等。
SDS-PAGE可以根据蛋白质的大小和电荷来分离，凝胶过滤层析则可以根据蛋白质的分子量和渗透性进行分离。
四、蛋白质纯化蛋白质分离后，还需要进行纯化以获得较高纯度的蛋白样品。
提取蛋白质步骤
提取蛋白质步骤蛋白质是生物体内最重要的官能分子之一，是组成生物体的重要基础。
在生物学领域，蛋白质的提取方法是非常重要的。
下面，我们将介绍蛋白质的提取步骤。
1. 细胞破碎蛋白质存在于细胞内，因此需要将细胞破碎，以释放蛋白质。
破碎细胞的方法有多种，如超声波破碎、高压破碎、玻璃珠破碎等。
2. 去除杂质细胞破碎后，需要去除杂质。
可以采用离心的方法，将混合液放入离心管中，通过高速离心，使得蛋白质与其他杂质分离出来。
此外，还可以使用滤纸、膜过滤等方法去除杂质。
3. 溶解蛋白质在溶液中存在，因此需要将其溶解。
常用的溶解液有生理盐水、PBS缓冲液等。
在溶解时，需要控制溶液的pH值和温度，以避免对蛋白质的影响。
4. 蛋白质分离蛋白质的分离方法有多种，如电泳、层析、免疫亲和等。
其中，电泳是常用的方法之一，可以根据蛋白质的大小、电荷等性质进行分离。
层析法根据分子量、亲和性等原理进行分离。
免疫亲和法则是针对特定蛋白质，利用抗体对其进行识别和分离。
5. 蛋白质纯化蛋白质分离后，还需要进行纯化，以去除杂质。
纯化方法有多种，如柱层析、凝胶过滤、亲和层析等。
不同的纯化方法适用于不同类型的蛋白质。
6. 蛋白质定量蛋白质定量是一个重要的步骤，可以确定提取的蛋白质含量。
常用的定量方法有比色法、Bradford法、BCA法等。
这些方法都可以通过对特定试剂与蛋白质反应，从而测定蛋白质的含量。
7. 蛋白质保存提取的蛋白质需要保存，以便后续实验使用。
常用的保存方法有冰冻保存、干燥保存等。
在保存时，需要注意蛋白质的稳定性，选择合适的保存条件。
总结以上是蛋白质提取的基本步骤，每个步骤都需要仔细操作，以确保提取出的蛋白质纯度和含量的准确性。
在实验过程中，需要根据具体情况灵活运用不同的方法，以提高蛋白质的提取效率和纯度。
《蛋白质的提取和分离》 讲义
《蛋白质的提取和分离》讲义一、蛋白质提取和分离的意义蛋白质是生命活动的主要承担者，对于生物体的结构、功能和代谢都起着至关重要的作用。
在科学研究、医学诊断、生物技术以及食品工业等众多领域，蛋白质的提取和分离都是一项关键的技术。
通过提取和分离特定的蛋白质，我们能够深入了解其结构和功能，从而揭示生命活动的奥秘。
在医学领域，对疾病相关蛋白质的提取和分离有助于疾病的诊断和治疗，例如肿瘤标志物的检测。
在生物技术中，获得高纯度的蛋白质可以用于生产生物制品，如胰岛素、抗体等。
此外，在食品工业中，提取和分离蛋白质可以改善食品的品质和营养价值。
二、蛋白质提取和分离的基本原理蛋白质的提取和分离基于其物理、化学和生物学特性。
常见的原理包括：1、溶解度差异不同的蛋白质在不同的溶剂中溶解度不同。
通过改变溶剂的性质，如 pH 值、离子强度、温度等，可以使目标蛋白质溶解或沉淀，从而实现分离。
2、分子大小和形状利用超滤、透析、凝胶过滤等方法，根据蛋白质分子的大小和形状进行分离。
大分子蛋白质无法通过特定孔径的滤膜或凝胶颗粒，而小分子蛋白质则可以通过。
3、电荷差异蛋白质具有不同的等电点（pI），即在特定 pH 值下蛋白质所带净电荷为零。
通过调节溶液的 pH 值，使蛋白质带上正电荷或负电荷，然后利用电泳或离子交换层析等方法进行分离。
4、亲和力差异某些蛋白质与特定的配体（如抗体、金属离子、染料等）具有特异性的亲和力。
利用这种亲和力，可以将目标蛋白质与其他蛋白质分离开来。
三、蛋白质提取的方法1、机械破碎法对于细胞或组织，使用匀浆器、研钵、超声波破碎仪等设备将其破碎，释放出其中的蛋白质。
2、化学渗透法使用一些化学试剂，如表面活性剂、有机溶剂等，改变细胞膜的通透性，使蛋白质释放出来。
3、酶解法利用蛋白酶将细胞间质或细胞壁分解，从而释放蛋白质。
在提取过程中，为了防止蛋白质的变性和降解，通常需要添加一些保护剂，如蛋白酶抑制剂、还原剂等。
四、蛋白质分离的方法1、盐析法向蛋白质溶液中加入中性盐（如硫酸铵、氯化钠等），随着盐浓度的增加，蛋白质的溶解度逐渐降低而沉淀析出。
蛋白质的提取、分离纯化及定量
实验一氨基酸的别离鉴定——纸层析法实验目的1.学习氨基酸纸层析的根本原理。
2.掌握氨基酸纸层析的操作技术。
实验原理纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。
层析溶剂由有机溶剂和水组成，滤纸和水的亲和力强，与有机溶剂的亲和和弱，因此在展层时，水是固定相，有机溶剂是流动相。
将样品点在滤纸上〔原点〕，进展展层，样品中的各种AA在两相溶剂中不断进展分配，由于它们的分配系数不同，不同AA随流动相移动速率就不同，于是将这些AA别离开来，形成距原点距离不等的层析点。
溶质在滤纸上的移动速率用比移〔rate of flow ,Rf〕来表示Rf= 原点到层析点中心的距离〔*〕/原点到溶剂前沿的距离(Y)只要条件〔如温度、展层剂的组成〕不变，*种物质的Rf值是常数。
可根据R f 作为定性依据。
Rf值的大小与物质的构造、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。
样品中如有多种AA，其中有些AA的Rf值一样或相近，此时只用一种溶剂展层，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，将滤纸转90度再用另一种溶剂展层，从而到达别离的目的，这种方法叫双向层析。
仪器、试剂1、扩展剂：是水饱和的正丁醇和醋酸以体积比4：1进展混合得混合液。
将20 ml正丁醇和5 ml冰醋酸放入分液漏斗中，与15 ml水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层，漏斗内即为扩展剂。
取漏斗内的扩展剂约5 ml置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒入培养皿中备用。
2、氨基酸溶液⑴.单一氨基酸：5%赖氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、⑵.混合氨基酸：各5 ml混合。
3、显色剂：0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。
4、层析缸、滤纸〔14*17〕、喷雾器、电吹风实验步骤1.放置平衡溶剂：用量筒量取约5 ml平衡溶剂，放入培养皿中，然后置于密闭的层析缸中。
2.准备滤纸：取层析滤纸〔长17㎝、宽14㎝〕一*。
在纸的一端距边缘2㎝处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔1.5㎝作一记号——点样线。
《蛋白质的提取和分离》 讲义
《蛋白质的提取和分离》讲义一、蛋白质提取和分离的意义蛋白质是生命活动的主要承担者，在生物体的生长、发育、代谢等过程中发挥着至关重要的作用。
对蛋白质进行提取和分离，有助于深入研究其结构与功能，了解生命活动的分子机制。
同时，这也是制备生物制品、研发新药、诊断疾病等领域的关键技术手段。
二、蛋白质提取的基本原理蛋白质提取的关键在于破坏细胞结构，使蛋白质释放出来，并保持其活性和完整性。
常用的方法包括机械破碎（如研磨、匀浆）、物理破碎（如超声破碎、渗透压冲击）和化学破碎（如使用表面活性剂、酶解法）等。
选择提取方法时，需要考虑蛋白质的性质（如溶解性、稳定性）、细胞类型以及后续的分离步骤。
例如，对于较为脆弱的细胞，可以采用温和的物理方法；而对于细胞壁较厚的细胞，则可能需要化学与机械方法相结合。
三、蛋白质分离的方法1、沉淀法（1）盐析沉淀：向蛋白质溶液中加入中性盐（如硫酸铵、氯化钠），随着盐浓度的增加，蛋白质的溶解度逐渐降低而沉淀析出。
不同的蛋白质在不同盐浓度下沉淀，从而实现初步分离。
（2）有机溶剂沉淀：向蛋白质溶液中加入能与水互溶的有机溶剂（如乙醇、丙酮），降低了溶液的介电常数，使蛋白质分子间的静电引力增加，导致蛋白质沉淀。
2、层析法（1）凝胶过滤层析：根据蛋白质分子大小进行分离。
大分子蛋白质不能进入凝胶颗粒内部，先被洗脱出来；小分子蛋白质则进入颗粒内部，后被洗脱出来。
（2）离子交换层析：利用蛋白质的带电性质。
带有不同电荷的蛋白质与离子交换剂结合的强度不同，通过改变洗脱液的离子强度或 pH 值，使蛋白质依次被洗脱下来。
（3）亲和层析：基于蛋白质与特定配体之间的特异性亲和力进行分离。
将配体固定在层析介质上，与配体结合的蛋白质被保留，未结合的蛋白质被洗脱，然后再用特定的洗脱液将结合的蛋白质洗脱下来。
3、电泳法（1）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：在电场作用下，蛋白质在凝胶中泳动，由于蛋白质的分子量、电荷等差异，其泳动速度不同，从而实现分离。
DNA的粗提取与鉴定PCR蛋白质的提取与分离
两个α－肽链 血红蛋白 两个β一肽链 四个亚铁红素基团
一、血红蛋白的提取和分离 1.分离生物大分子的基本思路：
选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。
2.蛋白质分离和提取的原理：
根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多 少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的 蛋白质。
方法步骤 1.制备鸡血细胞液 柠檬酸钠溶液
加入物质
目的 ① ② ③ ④ ⑤
2.提取鸡血细胞细胞核物质 20 m1 蒸馏水 3.溶解细胞核内的DNA 4.析出含 DNA 的黏稠物 5.滤取含 DNA 的黏稠物 6.将 DNA 的黏稠物再溶解 7.过滤含 DNA 的 NaCl 溶液 8.提取含有杂质较少的DNA 冷却的 95％的酒精 50 mL A:(1)向试管中加入0. 015 mol ／L 的 NaCl 溶液 5mL (2)加入 DNA 9.DNA 的鉴定 (3)4 mL 二苯胺试剂 B:(1)向试管中加入0.015mol／L 的 NaCl 溶液 5mL 2 mol／L 的 NaCl 溶液 20 mL 2 m1／L 的 NaCI 溶液 40mL 蒸馏水
答：前者是溶解DNA，后者是使DNA析出
3.DNA遇二苯胺(沸水浴)会染成( ) A.砖红色 B.橘黄色 C.紫色 D.蓝色
答：D
4.提取鸡血中的DNA时，为什么要除去血液 中的上清液? 答：DNA的提取，关键是对杂质的去除，由于 上清液是血液中的血浆部分，不含DNA，所以 要除去上清液(含有蛋白质)。
二、方法与过程
1.制鸡血细胞液（活鸡鲜血经分离或沉淀获得）
0.1g/mL柠檬酸钠100mL 500mL烧杯中，玻棒搅拌， 离心、分离或静置沉淀。 活鸡鲜血180mL 2.提取DNA。 ⑴.提取血细胞核物质： ①取血细胞5-10mL＋20mL蒸馏水，用玻棒沿一个方向 快速搅拌。 ②纱布过滤：滤液中含DNA和其他核物质，如蛋白质。 ③原理：血细胞的细胞膜、核膜吸水胀破，玻璃棒快速 搅拌，机械加速血细胞破裂。 ⑵.溶解核内的DNA： 滤液＋2mol/L的NaCl溶液40mL，玻棒沿一个方向 轻缓搅拌。
蛋白质的提取和分离实验操作
蛋白质的提取和分离实验操作蛋白质的提取和分离一样分为四步:样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。
(1)样品处理①红细胞的洗涤洗涤红细胞的目的:去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。
采集的血样要及时分离红细胞，分离时采纳低速短时刻离心，如500r/min离心2min，然后用胶头吸管吸出上层透亮的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水，缓慢搅拌10min，低速短时刻离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，说明红细胞已洗涤洁净。
洗涤次数、离心速度与离心时刻十分重要。
洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白;离心速度过高和时刻过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的成效。
②血红蛋白的开释将洗涤好的红细胞倒人烧杯中，加蒸馏水到原血液的体积，再加40%体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10min。
蒸馏水和甲苯作用:使红细胞破裂开释出血红蛋白。
③分离血红蛋白溶液将搅拌好的混合液转移到离心管中，以2000r/min的速度离心10min后，能够明显看到试管中的液体分为4层。
第1层为无色透亮的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透亮液体，这是血红蛋白的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。
将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透亮液体。
④透析取lmL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋故交盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12h。
(2)凝胶色谱操作①凝胶色谱柱的制作②凝胶色谱柱的装填将色谱柱垂直固定在支架上。
运算所用凝胶量，并称量。
凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，在与色谱柱下端连接的尼龙臂打开的情形下，一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时可轻轻敲动色谱柱，使凝胶装填平均。
色谱柱内不能有气泡存在，一旦发觉有气泡，必须重装。
装填完后，赶忙连接缓冲液洗脱瓶，在约50cm高的操作压下，用300ml的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液充分洗涤平稳凝胶12h，使凝胶装填紧密。
蛋白质的提取和分离
[复习]
思考1
分离生物大分子的基本思路是什么？
选用一定的物理或化学的方法分离具有 不同物理或化学性质的生物大分子。
思考2 蛋白质的分离和提取的原理是什么？
根据蛋白质各种特性的差异，如分子的 形状和大小、所带电荷的性质和多少、 溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲 和力等等，可以用来分离不同蛋白质。
琼脂糖凝胶电泳
4、血红蛋白
在红细胞的组成中， 约90%是血红蛋白。 它由四个肽链组成， 包括两个α—肽链和 两个β—肽链。每条 肽链环绕一个亚铁血 红素基团，可携带一 分子氧或一分子二氧 化碳。血红蛋白因含 血红素而呈现红色。
[蛋白质的提取和分离——实验操作]
1、选材 思考 人们用鸡的红细胞提取DNA，用人
2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中， 关于蛋白质的叙述，正确的是 A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于 相对分子质量较大的蛋白质 B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于 相对分子质量较大的蛋白质 C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于 相对分子质量较大的蛋白质 D 二者根本无法比较
3、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不 同蛋白质的电泳迁移率完全取决于 A 电荷的多少 B 分子的大小 C 肽链的多少 D 分子形状的差异 4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是 A 调节pH B 维持红细胞的能量供应 C 防止微生物生长 D 防止血液凝固
3、凝胶电泳法
（3）原理：
影响蛋白质分子运动速度的因素
决定 运动方向 电荷性质 √ √ √ √ √ √ √ 形成 库仑力 形成 阻力 决定 运动速率
电荷量
分子形状 分子大小
3、凝胶电泳法
蛋白质的提取和分离
第一节蛋白质的提取和分离科目：生物备案人：学生：时间：[知识梳理]一．背景知识1．常用的蛋白质分离提纯技术有和等。
其中技术最为快捷灵敏，简便易行。
2．电泳现象：。
3．电泳技术分离蛋白质的原理：。
4．聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：。
二．实践案例——血清蛋白的提取和分离1．材料用具（略）2．活动程序（1）点样：新配制血清5μL，与质量浓度为0.4g/mL的蔗糖溶液及质量分数为的指示剂等体积混匀后，用加样器吸取5μL样品，小心加到电泳样品槽的胶面上。
（2）．电泳：打开稳压稳流电泳仪的电源，将电流调节至mA，待样品进入分离胶后，改为mA,当溴酚蓝前沿距离硅胶框下缘时，将电流调回零。
关闭电源。
（3）．染色：取出凝胶，放入质量分数为的中，染色与同时进行，使染色液没过胶板，染色。
（4）．脱色：用体积分数为的浸泡漂洗数次，每隔更换脱色液，直至底色脱净，背景清晰。
（5）．烘干胶板：将已脱色的凝胶板放在保存液中浸泡然后将凝胶板放在两层透气玻璃纸中间，自然干燥即可获得血清蛋白的电泳谱带。
3．结果分析（1）分析没有出现电泳谱带的原因（2）通过辨认电泳谱带可初步判断血清中蛋白质的种类三．探究活动1．牛奶中酪蛋白的提取和检测提取原理：当pH= 时，酪蛋白的溶解度降低，并析出沉淀。
用除去酪蛋白中的脂肪后，即得到纯的酪蛋白。
检测原理：酪蛋白中的酪氨酸，能与起颜色反应，首先生成白色沉淀，加热后变成。
2．卵清蛋白的分离用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离（同上）四．意义1．胰岛素的提纯2．对细胞癌变做出诊断[复习指导]本节课复习以聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）为例，以电泳技术分离蛋白质的原理为基础，注重电泳技术的主要的步骤，明确点样、染色、脱色等在整个实验中的地位，明确各步骤所用试剂以及它们的作用。
[典题解析]下列叙述正确的是（）A．蛋白质中含有游离的氨基，是碱性电解质B．蛋白质中含有游离的羧基，是酸性电解质C．蛋白质在电场中可以向与其自身所带电荷相同的电极方向移动D．蛋白质在电场中可以向与其自身所带电荷相反的电极方向移动[解析] 电泳技术分离蛋白质的原理：蛋白质中既含有游离的氨基，又含有羧基，属于两性电解质，并且蛋白质在一定pH条件下带有电荷，作为带电离子，蛋白质在电场中可以向与其自身所带电荷相反的电极方向移动。
蛋白质的提取和分离一般分为四步样品处理11
蛋白质的提取和分离一般分为四步样品处理——粗分离——纯化——纯度鉴定1.样品处理(1)红细胞的洗涤①目的去除②方法离心（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头吸管吸出上层透明的，将下层的红细胞液体倒入再加入用的质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤⑤低速离心（低速短时间）⑥重复4、5步骤次，直至上清液中已没有，表明洗涤干净。
利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少。
(2)血红蛋白的释放加到体积，再加40％体积的溶解细胞膜），置于上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）, 细胞破裂释放出血红蛋白.(3) 分离血红蛋白溶液将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min ，试管中的溶液分为4层第1层（最上层）甲苯层第2层（中上层）的沉淀层，色薄层固体第3层（中下层）的水溶液层，的液体第4层（最下层）其它杂质的沉淀层(4)透析2.凝胶色谱制作1）凝胶色谱柱的制作①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。
②底塞的制作打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。
a、选择合适的的橡皮塞，中间打孔；b、在橡皮塞顶部切出锅底状的，在0.5ml的头部切下长的一段，插入橡皮塞孔内，上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。
c.剪尼龙网小圆片覆盖在上，用的尼龙纱将橡皮塞包好，插到玻璃管一端。
d、色谱柱下端用移液头部做，连接一细的，并用螺旋夹控制尼龙管的，另一端放入收集的收集器内③顶塞的制作插入安装了玻璃管的橡皮塞④组装将上述三者按相应位置组装成一个整体。
⑤安装其他附属结构。
2）凝胶色谱柱填料的处理（1）凝胶的选择。
（2）方法配置凝胶悬浮液计算并称取一定量的凝胶浸泡于中充分溶胀后，配成。
（3）凝胶色谱柱的装填方法①固定将色谱柱处置固定在支架上②装填将一次性的缓慢倒入内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。
③洗涤平衡装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分12小时。
蛋白质的分离过程
蛋白质的分离过程蛋白质是生物体内一类重要的有机化合物，其在细胞内发挥着多种重要的生物学功能。
为了研究蛋白质的结构和功能，科学家们经过多年的努力，发展出了一系列的蛋白质分离技术。
本文将从蛋白质的提取、分离和纯化三个方面介绍蛋白质的分离过程。
一、蛋白质的提取蛋白质的提取是蛋白质分离的第一步，其目的是将含有蛋白质的样品从细胞或组织中提取出来。
常用的提取方法有机械破碎法、溶液浸提法和超声波法等。
其中，机械破碎法是将样品经过机械力的作用破碎，释放出蛋白质；溶液浸提法是将样品放入适当的溶液中，使蛋白质溶解出来；超声波法则是利用超声波的作用力将蛋白质从细胞或组织中释放出来。
通过这些方法，可以获得含有蛋白质的提取液。
二、蛋白质的分离蛋白质的分离是将提取液中的蛋白质按照某种特定的性质进行分离的过程。
根据蛋白质的不同特性，可以采用不同的分离方法。
常用的分离方法有电泳法、层析法和离心法等。
1. 电泳法电泳法是利用蛋白质在电场中的运动性质进行分离的方法。
根据蛋白质的电荷、分子量或等电点的不同，可采用凝胶电泳、等电聚焦电泳等不同的电泳方法。
其中，凝胶电泳是将蛋白质样品通过凝胶的孔隙进行分离，常用的凝胶电泳有聚丙烯酰胺凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳等。
等电聚焦电泳则是根据蛋白质在等电点附近具有零电荷的特性进行分离。
通过电泳法，可以将蛋白质按照其电荷或分子量的大小进行分离。
2. 层析法层析法是根据蛋白质在某种固定相和流动相的作用下，通过不同的亲和性进行分离的方法。
根据固定相的不同，层析法可分为凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等多种类型。
其中，凝胶过滤层析是根据蛋白质的分子大小进行分离，较大分子的蛋白质会被阻滞在凝胶中，而较小分子的蛋白质则能通过凝胶。
离子交换层析则是根据蛋白质的电荷进行分离，蛋白质与固定相上的离子进行电荷交换，从而实现分离。
亲和层析是利用蛋白质与固定相上的配体之间的特异性亲和作用进行分离，通过调节流动相的条件，实现蛋白质的分离。
提取蛋白质的4种方法
提取蛋白质的4种方法1.离心法：离心法是一种基于蛋白质的大小和密度差异进行分离的方法。
它是最基本的蛋白质提取方法之一、在这个步骤中，样品通过离心机进行离心，这样会使蛋白质在管底或管顶形成一个沉淀或浮游。
通过离心，可以将细胞碎片、核酸和细胞器分离出来。
2.电泳法：电泳法是一种基于蛋白质的电荷和大小差异进行分离的方法。
电泳法可分为两种类型：SDS-和等电聚焦。
在SDS-中，蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶上通过电泳进行分离，根据蛋白质的大小产生不同的迁移速度。
而等电聚焦则是根据蛋白质的等电点（pI）进行分离。
3.柱层析法：柱层析法是一种基于蛋白质的亲和性、大小、电荷或亲水性进行分离的方法。
这种方法通过将样品与一个固相材料（如凝胶或颗粒）进行结合，然后通过流动相沿柱上运动，以分离和纯化蛋白质。
常用的柱层析方法包括气相色谱法、蛋白A/G层析法和亲和层析法。
4.免疫沉淀法：免疫沉淀法是一种利用抗体与蛋白质的特异性结合进行分离和纯化的方法。
在这个步骤中，抗体与特定的目标蛋白质结合，然后使用磁珠或琼脂糖等材料结合抗体，使其沉淀在底部。
通过将样品离心，可以将蛋白质与抗体沉淀分离。
总结蛋白质的提取方法有许多种，每一种都有其优势和适用范围。
离心法可以通过离心把蛋白质从其他细胞碎片和核酸中分离出来。
电泳法可以根据蛋白质的大小和电荷差异进行分离。
柱层析法可以根据蛋白质的亲和性和大小进行分离和纯化。
而免疫沉淀法则依赖于抗体与特定蛋白质的结合能力进行分离。
根据需要和实验室资源的可用性，选择适合的蛋白质提取方法可以确保蛋白质的高质量提取和纯化。
蛋白质的提取和分离
本
下保存备用(如图 2)。
课 2．琼脂糖凝胶电泳分离
栏 目
(1)制备琼脂糖凝胶
开
用__T_B_E__电__泳__缓__冲__液配制质量分数为 1%的琼脂糖
凝胶，_加__热__溶__解___后混匀，缓慢倒入胶床中，插入适
当的梳子，室温冷却至凝胶凝固。拔出梳子，将凝胶
放入电泳槽中，然后向电泳槽中加入适量 ___T_B_E__电__泳__缓__冲___液(如图 3)。
第14课时
b．洗脱开始，相对分子质量较小的蛋白质进入凝胶颗粒
内；相对分子质量较大的蛋白质被排阻在凝胶颗粒之外；
c．相对分子质量较小的蛋白质被滞留；相对分子质量较
本 大的蛋白质向下移动；
课
栏 d．相对分子质量不同的蛋白质分子完全分开；
目 e．相对分子质量较大的蛋白质行程较短，已从层析柱中
开
洗脱出来，相对分子质量较小的蛋白质还在行进中。
解析 同工酶催化的化学反应相同，但结构不完全相同，
乳酸脱氢酶的 5 种同工酶的相对分子质量是相同的。
整理ppt
12
学习探究区
第14课时
探究点二 乳酸脱氢酶同工酶的提取和分离
下面我们以乳酸脱氢酶同工酶的提取和分离为例，体验
蛋白质的提取和分离技术。
本 1．乳酸脱氢酶同工酶的提取
课
(1)取 5 g 新鲜的动物心脏，_漂__洗___干净后_剪__碎___到预
(4)区带易染色，样品易回收，有利于制备；
(5)操作简单、快速、灵敏。
整理ppt
11
学习探究区
第14课时
活学活用
1．下列说法中，不正确的是
(B )
本
A．同工酶催化的化学反应相同，但结构不完全相同
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4
温和的裂解方法
用于组成比较简单的样品，或分析某一特定 的细胞器。
常用方法：
（1）渗透裂解：血细胞、组织培养细胞
（2）冻融裂解：细菌、组织培养细胞；液氮 冻融
（3）去污剂裂解：用去污剂溶解细胞膜、裂 解细胞，释放内容物；用于组织细胞
（4）酶裂解细胞：植物、细菌和真菌等含有 细胞壁的细胞
➢ 两种广泛应用的技术可最低限度地减少样品制备的 污染：
（1）应用盐，主要是溴化钾，或更多的离液剂进行 清 洗，使与膜相互作用较弱的蛋白分离；
（2）应用去污剂分级除去膜样品制备中的可溶性杂 杂质。
22
➢ 膜蛋白是低丰度的、多为偏碱性、难溶于等电聚 焦的水相介质中的蛋白，很难出现在二维凝胶图 谱中。
9
样品制备的分类
➢ 可溶性样品制备 如血清、血浆、尿样、脑脊液以及细
胞和组织的水溶性提取物。 ➢ 组织样品制备 ➢ 细胞样品制备
体外悬浮培养生长的细胞或周期性细 胞样品（如红细胞、淋巴细胞） ➢ 样品分级 真核生物组织蛋白质
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可溶性样品制备
➢ 经过很少的前处理便可进行2-DE分析。
➢ 蛋白浓度高的样品，如血清、血浆，可用 适h TritonX100/EDTA
supernatent
pellet
Organelle Membranes
Extraction with SDS/EDTA
supernatent
pellet
Nuclear
Cytoskeletal (in SDS)
16
17
Subcellular Fractionation
➢ 含有较低蛋白质浓度或较高盐浓度的样品， 可通过透析或液相色谱脱盐，通过冻干、 对聚乙二醇的透析或TCA/丙酮沉淀的方法 进行浓缩。
11
组织样品制备
➢ 固体组织样品常在裂解液中破碎，最好的 方法是将组织在液氮中冷冻破碎。
➢ 组织样品存在样品异质性问题，通常采用 基于免疫亲和技术的正、负性选择，以富 集特殊的细胞群，裂解后可直接应用。
8
影响二维电泳图谱的杂质
1. 盐离子、痕量缓冲液和其它带电荷的小分子-透析 2. 内源小分子（如核苷酸、代谢物和磷酸）-TCA/丙酮 3. 离子去污剂-丙酮or低温沉淀 4. 核酸（RNA、DNA）-DNase/RNase 5. 多糖-硫酸铵or苯酚/醋酸胺 6. 脂类-去污剂 7. 酚类组分-PVP 8. 不溶物质-离心
➢ 目前，微量切割技术可以用来从组织样品 中获取纯的细胞群，其中最受关注的是激 光捕获微量切割技术（LCM）。
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细胞样品制备
➢ 细胞样品理想的方法是通过离心收集，随 后用磷酸盐缓冲液清洗并溶于样品缓冲液。
➢ 对于固体基质中培养的细胞，应先除去培 养基质，用PBS或等渗蔗糖溶液清洗细胞 层，然后再通过刮擦法收获细胞；或者加 入体积裂解缓冲液，直接将基质上的细胞 裂解。
Human mitochondrial proteins
Human nuclear proteins
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实例
1. 膜蛋白 2. 核蛋白
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膜蛋白的提取与分离
➢ 膜蛋白指多肽链跨越脂双层数次的蛋白， 被定义为膜整合蛋白或膜内在蛋白。
➢ 膜内在蛋白的跨膜结构域必须折叠形成α螺 旋或β片层的二级结构，
5
剧烈的蛋白裂解方法
常用于难于破碎的细胞，如固体组织内的细胞， 或具有坚硬细胞壁的细胞，如酵母细胞。 常用方法： （1）超声波裂解法：细胞样品 （2）弗氏压碎器：高压下迫使细胞穿过小孔径
而产生剪切力，从而裂解细胞；常用于 含有细胞壁的微生物、藻类 （3）研磨法：常用于固体组织、微生物；冻存于 液氮中，随后研磨成粉末 （4）机械匀浆法： （5）玻璃珠匀浆法：利用剧烈振荡的玻璃珠打破 细胞壁；用于细胞悬液或微生物
6
蛋白酶抑制剂
细胞裂解时，蛋白酶释放出来，会影响二维 电泳的结果，因此需采取措施抑制蛋白酶 的活性。 常用策略： （1）直接加入强变性剂 （2）低温、碱性条件下进行样品制备 （3）使用蛋白酶抑制剂（PMSF 、Protease
inhibitor cocktail)
7
蛋白沉淀方法
➢ 硫酸铵沉淀（盐析） ➢ TCA沉淀（三氯醋酸沉淀） ➢ 丙酮沉淀 ➢ 在丙酮中加TCA沉淀 ➢ 用苯酚提取，随后在甲醇中用醋酸铵沉淀
3
样品制备的原则
1.尽可能采用简单方法，以避免蛋白丢失； 2.细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白质的降
解，低温和蛋白酶抑制剂可防止蛋白质的降解； 3.样品裂解液应新鲜制备，并分装存于-80℃。勿反
复冻融已制备好的样品； 4.通过超速离心清除所有的杂质； 5.加入尿素之后加温不要超过37℃，防止氨甲酰化
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样品预分级
（1）蛋白质溶解性进行分级 （2）蛋白质在细胞中不同的细胞器定位进行
分级，如专门分离出细胞核、线粒体或 高尔基体等细胞器的蛋白质成分（亚细 胞分级）。 ➢ 样品预分级不仅可以提高低丰度蛋白质的 上样量和检测，还可以针对某一细胞器的 蛋白质组进行研究。
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亚细胞器分离与蛋白质提取
➢ 亚细胞器的纯化和分级可获得高度纯化和富集的 蛋白
➢ 膜蛋白处于细胞边界，在细胞的各种生命 活动中发挥重要作用。
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膜蛋白提取中有两点需要注意
（1）膜蛋白的纯度如何？ （2）膜蛋白很难出现在二维凝胶图谱中
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➢ 细胞在水相、去污剂中进行裂解时，细胞膜和内膜 网络将会断裂成碎片或颗粒，通过沉淀或分级技术 加以分离。但这些技术也能分离膜连的细胞器 。
第三章 蛋白质的提取与分离
1
3.1 蛋白质样品制备
2
➢ 目前，二维聚丙烯酰胺凝胶电泳依然 是大多数蛋白质组研究中复杂蛋白混 合物的核心技术。而选择合适的样品 制备方法对获得满意的二维电泳图谱 是十分重要的。
➢ 对不同类型的蛋白进行样品制备时， 需要采用不同的方法和条件。溶解的 效果依靠选择的细胞破碎方法、蛋白 解聚和溶解方法、去污剂和裂解液成 分等来实现。
➢ 依据密度差异进行细胞分级 ➢ 一般方法：低速离心分离出细胞核和未破碎细胞，
得到上清夜。然后梯度离心分离各种细胞器。
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Detergent Fractionation
Cells
Extraction with Digitonin/EDTA
supernatent
pellet
Cytoplasmic Fraction