基因重组与基因工程《生物化学》复习提要

基因重组与基因工程

第一节 DNA的重组

自然界不同物种和个体之间的基因转移和重组是经常发生的，它是基因变异和物种演变、进化的基础。

一、同源重组

同源重组：发生在同源序列间的重组称之，又称基本重组。以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的Holliday模型(1964年)

结果可产生片段重组体和拼接重组体两种重组体。

二、细菌的基因转移与重组

（一）接合作用

概念：当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA就可以从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌），此类型的DNA转移,称之。

只有某些较大的质粒，才能通过接合作用从一个细胞移至另一细胞。质粒双链DNA中的一条链就会切割、产生单链缺口，切口单链DNA通过鞭毛连接桥向另一细胞转移，随后在两细胞内分别以单链DNA为模板合成互补链。

（二）转化作用

1、概念：通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体

细胞获得新的遗传表型，这就是转化作用。即由外来DNA引起生物类型的改变过程。

2、本质：外来DNA重组(整合)到宿主细胞内表达新的蛋白质，（经过

复制、转录、翻译）——→经过转化，遗传类型改变。

但是，由于较大的外源DNA不易透过细胞膜，因此自然界发生的转化作用效率并不高，染色体整合几率则更低。

（三）转导作用

概念：当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来，再次感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用。

常见：噬菌体感染宿主时伴随基因转移；噬菌体感染宿主有两种结局：1）溶菌生长途径——噬菌体DNA在宿主菌内迅速增殖，产生新的病毒颗粒，溶解细菌，释放新生噬菌体；

2）溶源菌生长途径——噬菌体DNA整合进宿主染色体，随宿主DNA 复制而被动复制。

三、位点特异的重组

位点特异的重组：由整合酶催化、在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。

（一）λ噬菌体DNA的整合

（二）细菌的特异位点重组

沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变

（三）免疫球蛋白基因的重排

四、转座重组

概念：大多数基因在基因组内的位置是固定的，有些基因可以从一个位置移动到另一位置，这种由插入序列和转座子介导的基因移位或重排，称为转座。

（一）插入序列转座——两种形式

1、保守性转座：是插入序列从原位迁至新位；

2、复制性转座：是插入序列复制后，其中的一个复制本迁移至新位，另一个仍保留在原位。

（二）转座子转座

概念：转座子就是可从一个染色体位点转移至另一位点的分散的重复序列。

第二节重组DNA技术

一、重组DNA技术（或称基因工程）相关概念：

1、DNA克隆(分子克隆)：应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质

（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA 接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过

转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。

基因工程(genetic engineering) ——实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。

2、工具酶：在重组DNA技术中，常需要一些基本工具酶进行基因操作。

故称之。

如：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶Ⅰ、Klenow片段、反

转录酶、多聚核苷酸激酶、末端转移酶、碱性磷酸酶

限制性核酸内切酶

定义：限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。

分类：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）

Ⅱ类酶识别序列特点——回文结构

切口：平端切口、粘端切口

三类特殊性质的II型限制性内切酶：同功异源酶、同尾酶、可变酶

3、目的基因：需要特异表达的特定的DNA片段；这些感兴趣的基因或DNA

序列就是目的基因或目的DNA。

目的基因类型：cDNA和基因组DNA

3、基因载体：

定义：为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用

的一些DNA分子。

常用载体：质粒DNA、噬菌体DNA、病毒DNA

载体的选择标准：能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源DNA。

1.质粒

质粒——细菌染色体外的小型环状双链DNA分子

特点：

能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。这也是筛选转化子细菌的根据。

2. 噬菌体(phage)

λ噬菌体DNA改造系统：

λgt系列（插入型，适用cDNA克隆）

EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）

λ噬菌体DNA分子为双链线状，其末端分别具有突出的12bp的互补单链，是天然的粘性末端，称为COS位点。当感染细菌后，λ噬菌体借COS 位点互补连接形成双链环状结构。

λ噬菌体作为载体具有两个特点：

(1) λ噬菌体生长繁殖所必需的序列位于其左右两臂上含有30%的DNA是噬菌体生长所必需的。

(2) λ噬菌体的成熟需要包装，当与外源DNA片段重组后的大小介于原来的78%~105%之间时，重组的DNA分子才可包装为成熟的的λ噬菌体颗粒。

可将λ噬菌体载体分为插入型和置换型：

-----插入型允许克隆的外源DNA片段较小，一般为7kb以下；

-----置换型载体允许外源DNA代替自身的生长非必需区，可容纳30kb的外源DNA。

其他：

酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC)

细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC)

动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）

二、重组DNA技术基本原理

DNA克隆的基本原理和过程：目的基因的获取；克隆载体的选择和构建；

外源基因与载体的连接；DNA导入受体菌；重组体的筛选；克隆基因的扩增与表达