造血干细胞的研究进展

造血干细胞的研究进展

常灏

(中央民族大学 生命与环境科学学院 生物科学 北京 100081)∗

摘要 干细胞研究是一门新兴的学科。经过50多年的努力，造血干细胞的研究已经成为当今生物医学领域中发展最快的领域。文章从造血干细胞的生物学特征入手，介绍了造血干细胞的来源、分离纯化和检测方法、以及“可塑性”等方面的研究情况，并详细说明了一些主要的造血干细胞表面标志。最后，着重阐述了造血干细胞在干细胞移植、细胞治疗和基因治疗等方面的临床应用和前景。

关键词 干细胞 造血干细胞 表面标志 造血干细胞移植 基因治疗

引言 造血干细胞是发现最早、研究最深入、应用最广泛的一种成体干细胞，具有自我更新和多向分化潜能。从造血干细胞的生物学特征、来源、分离纯化和检测方法、“可塑性”研究，以及造血干细胞的临床应用等方面，概述了造血干细胞的研究进展，并对造血干细胞的表面标志和造血干细胞移植做了较为详细的阐述。从而使读者对造血干细胞的研究情况有一个整体的了解。

1 造血干细胞的生物学特征

目前，大多数生物学家和医学家认为，干细胞是来自于胚胎、胎儿或成体内具有在一定条件下无限制自我更新与增殖分化能力的一类细胞，能够产生表现型与基因型和自己完全相同的子细胞，也能产生组成机体组织、器官的已特化的细胞，同时还能分化为祖细胞。[1]

造血干细胞（Hematopoietic Stem Cell,HSC)是一小群具有高度的自我复制和多向分化潜能的最原始的造血细胞。[1]这就是说，造血干细胞具有两个重要的特征：其一，高度的自我更新或自我复制能力；其二，可分化生成所有类型的血细胞。[2]在发生学上，造血干细胞属于成体干细胞的一种。又因其可分化出至少12种血细胞，所以造血干细胞是一种多能的干细胞。

正常情况下，造血干细胞经过不对称性有丝分裂形成两个子代细胞。其中一个仍维持造血干细胞的全部特征，即自我更新(self-renewal)。自我更新使得干细胞池的大小(干细胞数量)和质量维持不变，因而又称为自我维持(self-maintenance)。另一个子细胞可能由于基因表达模式发生改变而使得细胞特征出现变化，从而逐步走上分化的道路。现已知道，造血干细胞不是纯一的细胞群体，而是由不同年龄等级的干细胞组成。这些不同年龄等级的干细胞的表面抗原、免疫表型和粘附分子的表达不一，生物学特性也有一定的差异。[3]

2 造血干细胞的来源

胚胎造血与出生后的较单一、固定的骨髓造血不同，它伴随着生长发育而不断变换造血部位。一般认为，随着胚胎发育过程中造血中心的转移，其造血过程相继分为三个阶段，即胚胎外造血期——卵黄囊造血期（人胚第13~16天）、胎肝造血期（人胚第6周至第5个月）和骨髓造血期（胚胎第四4个月开始至终生）。但有学者认为成体造血干细胞来源于胚胎的背主动脉区，因为能够重建成体各系造血的造血干细胞最早出现在鼠胚第10天的主动脉-性腺-中肾（AGM）区。而卵黄囊只是一种一过性的造血组织，不是胚胎发育过程中的第一个造血中心。至于骨髓造血干细胞，有人认为其来源于胎肝造血干细胞的迁移，也有人认为其来源于上述的AGM区，目前尚无定论。[2]

3 研究造血干细胞的技术

3.1 造血干细胞的表面标志

造血干细胞在细胞大小上类似于小淋巴细胞，细胞密度一般小于1. 066g/ml。[4]因此，至今仍不能单纯从形态学上来识别造血干细胞。而要对造血干细胞进行研究，首先必须能把它从造血组织中分离出来。最常用的方法就是利用造血干细胞表面的标志蛋白对其进行分离。

3.1.1 表面标志

人的造血干细胞表面标志包括CD34+、CD38－、Li n－、Thy-1+、Sca-1+、HLA-DR+、LFA-1+、CD45RA

∗指导教师：王斌

Tutor: Wang Bin

－、CD71－等。[5]人类造血干细胞还对5-氟脲嘧啶和4-氢过氧环磷酰胺有抗性。[6] CD34分子是一种跨膜的唾液黏蛋白，相对分子质量为115 KD，其编码基因位于第1号染色体长臂，基因长约26—28 kb，含8个外显子，[7]表达在造血干细胞、一部分造血祖细胞、小血管内皮细胞及胚胎成纤维细胞表面，是目前应用最广泛的造血干细胞表面标志。干细胞因子受体(SCF-R，又称c-kit，CD117)，广泛分布于造血细胞群中，约60%～75%的人类CD34+造血细胞同时表达c-kit受体。虽然CD34+细胞不全是造血干细胞，但是造血干细胞应全部表达CD34分子[1]，所以通过筛选CD34+细胞至少可以使造血干细胞得到富集。随着造血干细胞的分化成熟，CD34表达水平逐渐下降，成熟血细胞（Li n+）不表达CD34。[8]而最近的一些研究显示，CD34+Li n —造血细胞又起源于CD34—Li n—。CD34表面标志从无到有，又从有到无，充分显示了造血干/祖细胞产生、发育、分化和成熟的全过程。实际上，表型CD34+状态可能反映造血干细胞的激活状态。[9]CD34—细胞的发现正有力地支持了CD34+作为造血干/祖细胞的可靠标志需进一步的深入研究，也有助于在体外从胚胎干细胞诱导分化CD34+细胞的干细胞工程研究的不断深入。 [10]

依据细胞膜表面有无CD38抗原的表达，还可将CD34+细胞分为两个亚群：①CD34+CD38—细胞属于早期造血干细胞，与移植后的长期造血功能的重建有关。② CD34+CD38+细胞，为祖细胞亚群，与骨髓移植后的短期造血重建有关。

胸腺抗原-1（Thy-1，CD90）是造血干细胞的又一抗原标志。它比CD34分子出现得更早，表达在早期造血细胞表面。CD34+ Thy-1+细胞约占CD34+细胞群的0.1%—0. 5%，是具有高度自我更新能力和多项分化潜能的造血干细胞。因Thy-1+是造血干细胞表面的早期标志，故可利用其为标志进行造血干细胞的筛选。[11]干细胞抗原-1( Sca-1)，是小鼠Ly-6抗原家族的一员，除表达在干细胞表面外，在淋巴细胞特别是激活的淋巴及其他组织如脾脏红髓、胸腺髓质及肾小管区也有表达。[3]

血管内皮生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor-2,VEGFR-2,又称KDR），是新发现的一个造血干细胞的表面标志。在新生儿造血组织中，0.1%~0.5%的CD34+细胞表达KDR。研究发现，多能造血干细胞限于CD34+KDR+细胞部分，而CD34+KDR—细胞亚群则主要包括一些系特异的定向祖细胞。利用有限稀释法研究发现，骨髓中20%的CD34+KDR+细胞为造血干细胞，并且经过VEGF刺激后，这一比例可增加到50%以上。因此，KDR是一个可用于定义造血干细胞，并使其区别于造血祖细胞的阳性功能性标志。[12]

AC133分子也是新发现的造血干细胞表面标志之一，它被认为是更早期造血祖细胞和造血干细胞的特异性标记[2]。在2000年6月英国Harrogate召开的第七届人类白细胞分化抗原大会上正式命名为CD133。它是一相对分子质量为120 KD的糖蛋白，其N端连接20×103的聚糖，整个分子由一条长为865个氨基酸的多肽链组成。[13]N端位于细胞外，C端位于细胞内。AC133选择性地表达于人胎肝、骨髓和外周血中的CD34+造血干/祖细胞表面。与CD34抗原表达不同的是，AC133抗原不表达在人脐静脉血管内皮细胞、KGla细胞(AML细胞系)或纤维母细胞上，故有人认为AC133可替代CD34作为选择造血干/祖细胞的标志。[3]总之，有关造血干细胞表面标志的研究仍在进展之中，或许有一天人们会找到真正的造血干细胞的表面标志。

3.1.2 造血干细胞的三维空间结构特征

对于造血干细胞表型的描述，已成为造血干细胞研究领域的当务之急，然而综观国际，对人类CD34+造血细胞的研究均仅局限于其分离富集和生物学功能方面，罕见对其形态、细胞化学、超微结构、三维立体结构特征的研究。我国学者奚永志在国际上首次从体视学上揭示了人类CD34+造血细胞的三维空间结构特征，填补了这一空白。经扫描→模数转换→阴影校正→图像暂存→预处理→统计分析，结果表明，人正常骨髓CD34+造血细胞的直径3.490～6.741μm、周长11.776～26.240μm、面积9.565～35.686μm2、形状因子1.048～1.840、核质比0.58～0.72、平均光密度0.17675、积分光密度2717.217～9870.643。[10]

3.2 造血干细胞的分离纯化

近年来，造血干细胞表面标志研究的发展丰富了干细胞分离纯化的手段。根据造血干细胞的表面标志，可通过免疫细胞化学、流式细胞仪、分子杂交和PCR等多种细胞生物学和分子生物学手段来检测造血干细胞。[1]正如上述所提及的，现大多仍然基于对CD34+细胞的富集来筛选造血干细胞。通常先利用密度梯度