影响ELISA试验因素

实验过程中应注意的问题
试剂保存及使用前准备试剂盒保存于2-8℃ 试剂 Nhomakorabea保存于 ℃
使用前应先将检测试剂盒放置室温平衡15-30 使用前应先将检测试剂盒放置室温平衡 分钟， 分钟，保证酶等液体的初始反应温度及活性 剂的溶解。 剂的溶解。
真空包装袋漏气一般不影响试剂盒质量， 真空包装袋漏气一般不影响试剂盒质量，如 须拼组板条于板架上，必须保证板条放平， 须拼组板条于板架上，必须保证板条放平， 以免影响洗板机的操作。 以免影响洗板机的操作。
洗
板 2
4.洗板后，拍干包被板，应垂直扣在备好的 洗板后，拍干包被板， 洗板后 干净吸水纸或毛巾上， 干净吸水纸或毛巾上，且每次拍板应换掉 前次拍过的毛巾或吸水纸,避免交叉污染 避免交叉污染. 前次拍过的毛巾或吸水纸 避免交叉污染 5.洗液应调至适当的注出量，每孔应在 洗液应调至适当的注出量， 洗液应调至适当的注出量 350ul-450ul之间，但不要溢出孔外。 之间， 之间 但不要溢出孔外。
灰区的定义
灰区又称灰色带反应。 值在Cut 灰区又称灰色带反应。就是把 OD值在 值在 off 值正负 值正负10%这个范围内的标本称为灰区标 这个范围内的标本称为灰区标 本。 这个范围称为灰区。 这个范围称为灰区。
灰区的处理
1.灰区是客观存在的，没有不存在灰区的试剂。 灰区是客观存在的，没有不存在灰区的试剂。 灰区是客观存在的 我们只是尽量减少灰区的出现比例。 我们只是尽量减少灰区的出现比例。
问题８ 多次实验重复性差。 问题８：多次实验重复性差。 处理意见： 加样后充分混均 加样后充分混均。 处理意见：A加样后充分混均。 B尽可能使用同一加样器，装紧 尽可能使用同一加样器， 尽可能使用同一加样器 枪头。 枪头。 C测量波长保持一致。 测量波长保持一致。 测量波长保持一致 D加样量、加试剂量保持一致。 加样量、加试剂量保持一致。 加样量
显 色 1
1.试剂显色时先加 液，后加 液，二者不要颠倒 试剂显色时先加A液 后加B液 二者不要颠倒. 试剂显色时先加 2.前后加入的间隔时间不要超过 分钟 前后加入的间隔时间不要超过10分钟 前后加入的间隔时间不要超过 分钟. 3.若把 液和 液先混和，再加样显色，需要求二 若把A液和 液先混和，再加样显色， 若把 液和B液先混和 者等体积混合。 者等体积混合。 4.底物溶液 应是澄清透亮，如倒出发现溶液已呈 底物溶液B应是澄清透亮 底物溶液 应是澄清透亮， 微兰色，表明液体已受污染，应废弃不用。 微兰色，表明液体已受污染，应废弃不用。
洗
板 1
1.要有适当的浸泡时间（30~60秒）。 要有适当的浸泡时间（ 要有适当的浸泡时间 秒 2.洗板机吸液要彻底 残余量低于 。 洗板机吸液要彻底,残余量低于 洗板机吸液要彻底 残余量低于5ul。 3.洗板次数应与说明书要求一致，尽量不要私自 洗板次数应与说明书要求一致， 洗板次数应与说明书要求一致 增加或减少洗板次数。 增加或减少洗板次数。
加 样
仔细注意加样全部过程. １.仔细注意加样全部过程 仔细注意加样全部过程
2.加样后及时放入孵育箱 ， 避免包被板在室温 加样后及时放入孵育箱， 加样后及时放入孵育箱 放置时间过长。 放置时间过长。
3.标本较多时，请分批操作。 标本较多时，请分批操作。 标本较多时
温 育
1.按规定加盖封板膜。 按规定加盖封板膜。 按规定加盖封板膜
处理意见： 假阳性标本表现在临界值附近较 处理意见：D假阳性标本表现在临界值附近较 多，通常与当时实验的水平有关， 通常与当时实验的水平有关， 注意检查实验条件的波动 。 E避免加样时间过长 。 避免加样时间过长 F由于试剂盒灵敏度过高而造成临 由于试剂盒灵敏度过高而造成临 床假阳性偏高的结果。 床假阳性偏高的结果。
显
色 2
5. 将加样槽清洗干净。 将加样槽清洗干净。 6.A、B液应避免接触污物 。 、 液应避免接触污物 7.不同厂家显色液不得混用。 不同厂家显色液不得混用。 不同厂家显色液不得混用
终止和读数
1．加完终止后30分钟内读取数据。 ．加完终止后 分钟内读取数据 分钟内读取数据。
2．读板时板底如果不清洁，就会导致所读的 ．读板时板底如果不清洁， 数据不准确， 数据不准确，所以在读数前尽量保证酶标 板的底部是清洁的。 板的底部是清洁的。
问题2： 问题 ：质控品漏检
处理意见： 处理意见：检查质控品是否有反复冻融 的情况、 的情况、质控品是否有批内 差异、质控品是否为 摄氏度 差异、质控品是否为4摄氏度 久置。 久置。
问题３ 日常使用中出现弱阳性标本漏检。 问题３：日常使用中出现弱阳性标本漏检。
处理意见： 标本本身由于各种因素影响而表现 处理意见：A标本本身由于各种因素影响而表现 为弱阳性，实际上为阴性标本。 为弱阳性，实际上为阴性标本。 B由于标本自身含量较低，易随实 由于标本自身含量较低， 由于标本自身含量较低 验水平位试剂盒调整等因素波动， 验水平位试剂盒调整等因素波动， 对这部份标本的处理应格外慎重， 对这部份标本的处理应格外慎重， 有条件的地区应进行确证实验。 有条件的地区应进行确证实验。
加抗凝剂的标本处理
１．标本采集后，应先将标本３７度或者 标本采集后，应先将标本３７度或者 ３７ 室温放置一定时间． 室温放置一定时间． ２．标本应进行离心：采用３０００转速 标本应进行离心：采用３０００转速 ３０００ 离心10－15分钟． 离心 － 分钟． 分钟 3.取上清液加样 取上清液加样. 取上清液加样
标本处理的意义
标本处理过程严谨， 标本处理过程严谨，可最大限度避免由 于标本因素造成的非特异反应对实验的 影响，最大限度避免重复实验 增加不 影响，最大限度避免重复实验,增加不 必要的工作量. 必要的工作量
试
剂
1.观察外包装，内组份有无漏液。 观察外包装，内组份有无漏液。 观察外包装
2.仔细阅读说明书，严格按照试剂说明书进行操作。 仔细阅读说明书，严格按照试剂说明书进行操作。 仔细阅读说明书
洗
板 3
6.稀释洗液应用蒸馏水或去离子水，pH 稀释洗液应用蒸馏水或去离子水， 稀释洗液应用蒸馏水或去离子水 值不宜过酸或过碱， 值不宜过酸或过碱，保证配出的洗液 pH值7.4±0.2，水质宜新鲜，长菌或 值 ± ，水质宜新鲜， 有沉淀不宜使用， 有沉淀不宜使用，水保存应用非金属 容器。 容器。 7.稀释好的洗液 度情况下可保存 稀释好的洗液4度情况下可保存 稀释好的洗液 度情况下可保存3--5天. 天 8.由于洗涤液系高浓度磷酸盐，可能会形成 由于洗涤液系高浓度磷酸盐， 由于洗涤液系高浓度磷酸盐 结晶，配制洗液时应完全溶解. 结晶，配制洗液时应完全溶解
2.按说明步骤严格控制孵育时间。 按说明步骤严格控制孵育时间。 按说明步骤严格控制孵育时间
3. 严格控制温育仪器 （ 水箱 、 温箱 、 全自动酶免 ） 严格控制温育仪器（水箱、温箱、全自动酶免） 的温度， 建议在仪器内放置测量工具（ 的温度 ， 建议在仪器内放置测量工具 （ 全自动酶 免除外） 免除外）。
处理意见： 注意检查实验中所用的仪器设备 处理意见：C注意检查实验中所用的仪器设备 是否定期校准。 是否定期校准。 D注意检查实验中所用的板、酶标 注意检查实验中所用的板、 注意检查实验中所用的板 试剂的批号是否在有效期之内. 试剂的批号是否在有效期之内
问题４ 问题４：质控品灵敏度偏高 。
处理意见： 处理意见：卫生部临检中心的质控品存在 批间批内差异。 批间批内差异。 实验室相关条件改变导致质控变化。 实验室相关条件改变导致质控变化。
问题７ 临床实验中出现假阳性偏高。 问题７：临床实验中出现假阳性偏高。 处理意见： 注意检查洗涤液中结晶部份是否 处理意见：A注意检查洗涤液中结晶部份是否 完全溶解。 完全溶解。 B注意检查实验中所使用的仪器设 注意检查实验中所使用的仪器设 备是否定期校准 。 C注意检查实验中所用的板、酶标 注意检查实验中所用的板、 注意检查实验中所用的板 试剂的批号是否相同， 试剂的批号是否相同，不同批号 试剂不得混用。 试剂不得混用。
问题５ 多次实验灵敏度一直偏低。 问题５：多次实验灵敏度一直偏低。 处理意见： 保存环境不规范 保存环境不规范。 处理意见：A保存环境不规范。 B孵箱温度不足。 孵箱温度不足。 孵箱温度不足 C温育时间不足。 温育时间不足。 温育时间不足
问题６ 问题６：单次实验中出现假阳性 处理意见：注意实验过程中的影响因素， 处理意见：注意实验过程中的影响因素，特 别是实验中的洗板应设置浸泡 30---60秒时间。 秒时间。 秒时间
2.减少灰区最有效的方法就是尽量将板洗涤干 减少灰区最有效的方法就是尽量将板洗涤干 净。
3.严格控制温浴时间。 严格控制温浴时间。 严格控制温浴时间
问题1： 问题 ：只有单次实验出现灵敏度偏低或 者偏高。 者偏高。 处理意见：重新实验， 处理意见：重新实验，并在实验中注意试 剂盒的温度平衡、温育的时间、 剂盒的温度平衡、温育的时间、 显色的时间等影响因素的控制 显色的时间等影响因素的控制 。
不加抗凝剂的标本处理
１．标本采集后，应先将标本３７度放 标本采集后，应先将标本３７度放 ３７ ３０－６０分钟 分钟． 置３０－６０分钟．
２．标本应进行离心：采用３０００转 标本应进行离心：采用３０００转 ３０００ 速离心15－ 分钟 分钟． 速离心 －20分钟．
3.取上清液加样 取上清液加样. 取上清液加样