第六章植物制药

生长调节剂、氧气和酸度、渗出物 （3）两步培养法 第一步使用适合细胞生长的培养，营
养丰富； 第二步使用适于次级代谢产物合成的
培养基，较低含量的硝酸盐和磷酸盐， 并含有较低的糖分或少量的碳源。
（4）诱导子
2、培养环境的外部因素
（1）温度： （2）搅拌频率： （3）培养容器的影响： （4）光的影响：
第五节 植物细胞培养实例
一类是后含物，储藏物质或废弃 物质，分布于液泡内，糖类、盐类、 生物碱、苷、有机酸、挥发油等，
另一类是生理活性物质，对细胞内 生化代谢和生理活动起着调节作用。
细胞后含物
生物碱：含氮有机化合物，中药含 有多种生物碱，麻黄碱，咖啡，阿托品， 奎宁，黄连素。
糖苷类：某些化合物和糖 竟糖苷键 结合而成，对疾病有很好的治疗作用。
常用固化剂有琼脂、明胶、藻酸盐、羟 乙基纤维素。
液体培养系统包括：
悬浮培养：静止培养和振荡培养 成批培养 半连续培养 连续培养
1、成批培养法：将培养基一次 性加入反应器中，接种、培养一定 时间后收获细胞的操作方式。
最适于植物细胞培养的是气升式 反应器。
两步培养法，使用两个反应器第 一个用于细胞生物量的累积，第二 个用于次级代谢产物的生产。
（3）西洋参细胞悬浮培养：培养基为添加 1.25mg/L 2,4-D、0.4mg/L KT及0.7g/L酪蛋白水 解物的MS培养基。500毫升三角瓶装量为100毫 升，酸度为5.8，在0.1MPa压力下灭菌15-20分， 冷却至室温备用。然后，在无菌操作条件下用 50毫升培养基将每瓶西洋参愈伤组织无性系洗 下并通过筛网流入无菌量筒中，沉淀10-15分， 倾去上清液，下层细胞倾入含100毫升培养基的 500毫升培养瓶中，接种量为1-2克/升细胞干重 然后至摇床中，于27-29度，以120转/分速度振 荡，振幅为2.5 厘米，培养20-25天后即得西洋 参细胞悬浮培养物。
产物易被固相吸附或被有机相溶解； 两相易分离； 如为固相不吸附培养基中的添加成 分，植物生长调节剂或有机成分。
四、毛状根和冠瘿瘤培养
1、毛状根培养 利用发根农杆菌的转化作用
进行次级代谢产物的生产，极具 发展前途，其生长快速和次级代 谢产物含量高，特别适用于从木 本植物和难于培养的植物中得到 较高含量的次级代谢产物。
5、维生素：通常是维生素自养 型，但大多数不能满足需要。
二、培养方法
原生质体和单细胞培养（对象） 固体和液体培养（培养基类型） 悬浮和固定化细胞培养（培养方式）
固体培养包括：琼脂培养和固定化培养， 优点：简便易行、所占空间小 缺点：外植体或愈伤组织仅有一部分与
培养基接触，培养基中产生浓度差，愈伤 组织生长不平衡；外植体基部插入培养基 中，该处气体交换不畅阻碍了组织呼吸正 常进行，堆积生长过程中的有害物质；在 愈伤组织细胞间出现极化现象细胞群体不 均一。
常用表面灭菌方法。选用灭菌后易 于除去或容易分解的试剂。根据所处 理材料对灭菌试剂的敏感性选择适当 的处理时间。
常用灭菌试剂有次氯酸钙、次氯酸 钠和氯化汞。
次氯酸钙为工业漂白粉过滤后的饱 和溶液，适用于草本植物和柔软组织 的灭菌处理，时间为5-30分。
氯化汞灭菌效果好，但不易除去， 时间不易过长，以免杀死植物细胞， 当其用于休眠种子的灭菌剂最为理想， 适用浓度为0.1%，2-10分，种子皮较 厚时可延长至20分以上。
2、半连续培养法：
在反应器中投料和接种培 养一段时间后，将部分培养液 和新鲜培养液进行交换的培养 方法。
3、连续培养法：
利用连续培养反应器，在投料 和接种一段时间后，以一定的速 度连续采集细胞和培养液，并以 同样速度供给新鲜培养基以使细 胞生长环境维持恒定。
4、固定化培养法：固定化反应器有网状多 孔板、尼龙网套和中空纤维膜等多种类型。
第六章 植物细胞制药
第一节 概述 一、基本概念
1、植物组织和细胞培养 植物组织和细胞培养是指在无菌和人工
控制的营养（培养基）及环境条件（光照 、wk.baidu.com度）下，研究植物的细胞、组织和器 官以及控制其生长发育的技术。
植物无菌培养包括：
植物培养 愈伤组织培养 悬浮培养 器官培养 胚胎培养
二、植物细胞培养的发展简史
西洋参属于五加科人参属植 物，为名贵中药材之一，具有降 血脂、镇静、造血及健胃作用， 其所含的主要有效成分为皂苷， 目前尚不能人工合成，但可通过 细胞培养技术来制备。
1、工艺流程 西洋参根→无菌根→愈伤组 织→悬浮细胞培养物→发酵 液→细胞→西洋参细胞干粉成品
2、工艺过程
（1）西洋参细胞种质选择与处理： 取人工栽培的西洋参根，用小刷子于流 动的自来水下充分洗净，然后将其切成 50-100mm厚的片段，浸入70%乙醇中30 秒 ， 取 出 浸 于 5% 安 替 福 民 （ 含 有 效 氯 5.25%的氯化钠溶液 ）、10%漂白粉或 0.1%升汞溶液中10-20分，取出后用无菌 水充分洗去消毒剂，备用。
将细胞固定在尼龙网套内或固定于中空纤维 膜反应器的膜表面，或固定于网状多孔板上， 放在培养液中进行培养，或连续通入新鲜培养 基，进行连续培养又连续收集细胞，可通入净 化空气代替搅拌。
固定化的优点是细胞位置固定，易于获得高 密度细胞群体和维持细胞间的物理化学梯度， 利于细胞组织化，易于控制培养条件及获得次 级代谢产物。
一、诱导子
在植物细胞培养中加入 诱导子可以提高次级代谢产 物的产量，并可促进产物分 泌到培养基中。
二、前体饲养
增加次级代谢产物产率的重要 方法，次级代谢产物的合成依赖于3 中主要原材料的供应，莽草酸是芳香 氨基酸、肉桂酸和某些多酚化合物的 前体；氨基酸，形成生物碱及肽类抗 生素；乙酸，是聚乙炔类、前列腺素 类、大环抗生素，多酚类，类异戊二 烯等的前体。
四、植物培养细胞的生理特性
植物细胞重量的增加主要在 对数期，次级代谢产物的累积主 要在稳定期。
植物细胞多以非均相集合体的细胞团 形式存在，细胞团产生的原因有：
细胞分裂之后没有进行细胞分离； 在间歇培养过程中细胞处于对数生长 后期时，开始分泌粘多糖和蛋白质，或 以其他方式形成粘性表面，从而形成细 胞团。外骨架相当脆弱，表现为抗张力 强度大，抗剪切力能力小。
（2）愈伤组织的诱导：诱导西洋参愈伤组织 的培养基为添加2.5mg/L 2,4-D、0.8mg/LKT及 0.7g/L酪蛋白水解物的MS培养基。50mL三角 瓶装量为20mL，琼脂浓度为0.8%，灭菌后备 用。然后取已消毒的西洋参根的片段，切成 1mm厚，4-5mm见方的立方小块组织，再向每 个培养瓶中接1g左右的小组织块，于25-26度培 养20天后即长成愈伤组织。采用同样培养基进 行移植继代培养，移植过程每瓶均用同一块愈 伤组织切割分散和接种培养。如此往复循环， 进行20-30次移植继代培养，即可获得多个西洋 参愈伤组织无性系。
三、两相培养法
出发点是在细胞外创造一个次级 代谢产物的储存单元。可加入固相或 疏水液相，形成两相培养体系，从而 达到收集分泌产物的目的。可减轻产 物本身对细胞代谢的抑制作用，并可 保护产物免受培养基中催化酶或酸对 产物的影响。可简化下游处理过程， 降低生产成本。
两相培养系统需满足下列条件：
添加的固相或液相对细胞无毒害作 用，不影响细胞生长和产物合成；
4、工业培养条件：培养罐 类型、通气、搅拌和培养方式。
一、外植体的选择 在生长曲线的不同时期，累
积不同的产物。
二、培养条件的影响 营养成分、生物及非生物元 素、酸度、通气以混合程度、与 接种有关的因素以及剪切力、搅 拌频率、温度和光。
1、内在因素 （1）接种和诱导： （2）培养基的组成：糖的作用、植物
所有植物细胞都是好气的， 但培养时不需要很高的气液传质速 率，而是要控制氧量，以保持较低 的溶氧水平。
泡沫性质不同于发酵，气泡 大，黏度也大，通常要采用化学或 机械方法加以控制。培养过程中可 能会黏附于反应器壁上，电极或挡 板上。
第三节 植物细胞培养的 基本技术
一、植物材料的准备
用于植物组织培养的外植体必须无 菌，如果含有其他微生物，在培养基中 ，其他微生物会大量迅速繁殖从而影响 植物组织的培养。
二、机构特性
高等植物为真核生物，在光学显微 镜下，细胞壁、细胞核和液泡以及细胞 内一些较大的结构容易辨认，植物细胞 由细胞壁和原生质体组成，原生质体包 括细胞质、细胞核和液泡。与动物细胞 相比植物细胞有三个特点，细胞壁、液 泡和质体。
三、细胞后含物和生理活性物质
细胞中除含有生命物质原生质体 外，还有许多非生命物质，细胞的代 谢产物：
第四节 影响植物次级代谢产物 累积的因素
影响次级代谢产物产生和累积的 因素主要有：
1、生物条件：外植体、季节、休 眠、分化等；
2、物理条件：温度、光（光照时 间、光强、光质）、通气（氧气）、 酸度和渗透压；
3、化学条件：无机盐、碳 源、物质生长调节剂、维生素、 氨基酸、核酸、抗生素、天然物 质和前体等；
60年代初，分离出植物的原生质体。 60至70年代中叶，开发培养基和研究培养方法。 75-85年优化细胞生长和次级代谢产物形成的研究。
第二节 植物细胞的形态和
生理特性
一、形态
单细胞植物，藻类；多细胞植物其细胞 形态多种多样，球形、类圆形、椭圆形、 角形；具有支持作用的细胞细胞壁常增厚 ，类圆形、纺锤形；具有输导作用的细胞 管形。细胞大小不一，基本组织细胞体积 较大直径在20-100微米之间，储藏组织细 胞的直径可达1毫米，最长的细胞是无节乳 管长达数米至数十米。
（5）细胞收获与干燥：细胞大量 培养结束后，用过滤或离心方法收 集细胞，用去离子水洗涤3-5次，每 次 抽 干 ， 然 后 于 50 度 以 下 真 空 干 燥 或冻干，即得培养的西洋参细胞干 粉，收率为3-5克/升干重。
第六节 进展和展望
20世纪90年代以来，对于植物细 胞及其代谢产物的研究进入了新的发 展时期，并出现了很多新技术和新方 法，比如诱导子、前体饲养、两相培 养法、质体转化、毛状根和冠瘿瘤组 织培养等，显示了植物细胞培养工程 制药的广阔发展前景。
挥发油：具有芳香气味， 薄荷油、 丁香油和桉油。
有机酸：糖类代谢的中间产物，苹果 酸、柠檬酸、水杨酸、酒石酸。
生理活性物质：对细胞内生化反应 和生理活动起调节作用。
酶类：生物催化剂； 维生素：参与酶的形成，对生 长、呼吸、物质代谢有调节作用； 植物激素：调节代谢； 抗生素和植物杀菌素：杀死和 抑制某些微生物生长的物质。
常见的植物激素有生长素、分 裂素、赤霉素、脱落酸、乙烯。
植物组织和细胞培养物的生长 过程主要取决于生长素和分裂素的 比例，比值高可刺激细胞分裂，比 值低则刺激细胞生长。
对于植物培养细胞，绝大多数 培养基中都必须加入一定量的生长 调节剂。
4、有机氮源：常用蛋白质水解 物或各种氨基酸，有机氮源对细胞 的早期生长有利，氨基酸的加入是 为了代替或增加氮源的供应。
（4）西洋参大量培养：培养基与 细 胞 悬 浮 培 养 相 同 ， 反 应 器 为 10 升 通气搅拌罐，培养基充满系数为0.70.8，将上述悬浮细胞培养物直接接 种至搅拌罐反应器中，细胞接种量 为 1-2 克 / 升 干 重 ， 在 27-29 度 下 ， 以 50-70转/分搅拌速度及0.6-0.8立方米/ 立方米*分通气速度培养18-20天，即 得西洋参细胞培养物。
二、培养基及其组成
1、无机盐：有大量元素和微量元 素，30毫克每升为界限。
大量包括：氮、硫、磷、钾、镁、 钙、氯、钠。
微量包括：铁、锰、碘、钼、铜、 锌。
2、碳源：常用碳源为碳水化 合物、肌醇、甘油、乳糖和半乳 糖。
天然提取物如椰子乳、对愈 伤组织的诱导和培养也有重要意 义。
3、植物生长调节剂：植物激 素是植物代谢过程中形成的生长调 节物质，在极低浓度（小于1微摩尔） 时即能调节植物的生育过程，并能 从合成部位转运到作用部位而发挥 作用。
19世纪上半叶，提出了细胞学说，20世纪初叶，德 国著名植物学家首次提出了高等植物的器官和组织可 以不断分割，直至单个细胞。
20世纪20年代初至30年代，胚胎培养和器官培养取 得了一些成果。
30年代末至40年代，植物细胞器官与营养需求之间 的关系。
40年代末至50年代，确定了腺嘌呤和生长素的比例 是控制芽和根形成的主要条件之一。