人羊水来源干细胞治疗大鼠卵巢早衰的初步研究
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【关键词】 羊水干细胞； 移植治疗； 大鼠； 卵巢早衰； 雌二醇 中图分类号： R711． 75 文献标志码： A 文章编号： 1004－7379（ 2012） 02－0116－04
Preliminary study on the effects of human amniotic fluid-derived stem cells on rats＇premature ovarian failure． Li Jie，Zhang Jianfang，Bai Lu，et al． Department of Gynecology and Obstetrics，Xijing Hospital，Fourth Military Medical University，Xi＇an 710032
DOI:10.13283/j.cnki.xdfckjz.2012.02.003
现代妇产科进展 2012 年 2 月第 21 卷第 2 期 Prog Obstet Gynecol，Feb． 2012，Vol. 21，No. 2
·论著·
人羊水来源干细胞治疗大鼠卵巢早衰的初步研究
李 洁，张建芳，白 璐，陈必良*
116
现代妇产科进展 2012 年 2 月第 21 卷第 2 期 Prog Obstet Gynecol，Feb． 2012，Vol. 21，No. 2
断时经羊膜穿刺获取，也可在分娩过程中收集。不 会对母亲和胎儿造成伤害，安全性高，而且不涉及伦 理道德问题［2］。本实验室采用贴壁法分离、多次传 代扩增方法获得羊水干细胞。获得的羊水干细胞表 达胚胎干细胞表面标志和间充质干细胞表面标志， 不表达造血干细胞表面标志。实验验证了羊水干细 胞的分化潜能，在神经诱导基、成骨诱导基、成脂诱 导基培养条件下，羊水干细胞在体外可以分化出神 经细胞、成 骨 细 胞 和 脂 肪 细 胞。本 实 验 旨 在 研 究 AFS 在细胞治疗方面的作用，探讨其用于治疗卵巢 早衰的可能性。实验获得第四军医大学西京医院伦 理委员会批准。 1 材料与方法
1． 1 材料来源 SD 大鼠： 12 周龄，健康，雌性，体重 250 ～ 270g，由第四军医大学动物实验中心提供。隔日换垫料，自 由饮食，室温控制在 25℃ ，湿度 70% ，通风良好。入组标准： 动物购入后适应性喂养 2 ～ 3 天，连续 5 ～ 10 天做阴道涂片， 有动情周期的大鼠纳入实验组。标准混合饲料由第四军医 大学动物实验中心提供。 1． 2 主要试剂与仪器 T104 羊水细胞培养基（ Irvine Scientific 公司） ，胰 蛋 白 酶、EDTA、DMEM、胎 牛 血 清 （ Gibco 公 司） ，雷公藤多苷片（ 湖南协力） ，载玻片（ 深圳康乃馨生物） ； HE 染色剂（ 北京安柏定） ； 离心机（ Saitexiangyi TDSA-WS） 。 1． 3 实验方法 1． 3． 1 羊水干细胞培养 复苏来源于第四军医大学妇产科 实验室的羊水干细胞，此羊水取自妊娠 16 ～ 22 周行产前遗 传学诊断的健 康 孕 妇，取 标 本 前 均 征 得 孕 妇 本 人 及 家 属 同 意。将干细胞接种于培养瓶，加入 T104 培养基（ 含 1% 青霉 素 / 链霉素） ，置饱和湿度、37℃ 、5% CO2 培养箱中培养。此 后每 2 ～ 3 天 换 液，至 80% 细 胞 融 合 时 以 0． 25% 胰 酶 + 0． 02% EDTA 消化细胞，按 1 ∶ 3 传代。 1． 3． 2 动物卵巢早衰模型的制备 适应性喂养后，大鼠按 体重随机分为 4 组，A 组： 正常对照组，B 组： 模型组，C 组： AFS 一次移植组，D 组： AFS 两次移植组。研碎雷公藤多苷 片后，用三蒸水溶化配药。除 A 组外，其余各组大鼠于晨 9 时灌雷公藤多苷片 50mg / （ kg·d） ，每日 1 次，连续灌胃 14 天［3］。 1． 3． 3 移植方法 C 组于第 14 天以尾静脉注射方式每只 大鼠一次性移植 2 ×106 P8 AFS，D 组分别于第 1 天和第 7 天 以尾静脉注射方式每只大鼠移植共 2×106 P8 AFS，AFS 以 1ml BS 悬匀。 1． 3． 4 处理方法 各组大鼠均于末次灌药后一周处死，处 死前禁食 4h 并称量大鼠体重，经腹主动脉取血，留取血标本 测定相关指标并处死大鼠，剖腹取卵巢和子宫，置于中性福 尔马林液固定。 1． 3． 5 观测指标 实验结束前 10 天开始将各组大鼠阴道 涂片，每日 1 次，连涂 10 天，观察比较各组大鼠动情周期。
【Abstract】 Objective： To evaluate its the treatment effects on rats＇premature ovarian failure． With transplant human amniotic fluid-derived stem cells by caudal vein injection，Methods： SD rats were randomly divided into four groups by weight： group A（ normal group） ，group B（ model group） ，group C（ once transplantation group） ，group D（ twice transplantation group） ． Except group A was perfused with physiological saline，other groups were perfused with Tripterygium Glucosides tablet for 14 days； then group C transplanted AFS once on the 14th day after gastric perfusion，group D transplanted AFS twice on the 1st day and the 7th day after gastric perfusion． Rat＇s vaginal smears，serum sex hormone levels and the morphological changes of rats＇ovary organizations were observed． Results： The treatment effects of AFS on Rats＇premature ovarian failure： （ 1） The estrous cycle of group B was significantly prolonger than that of group A． Both group C and group D recovered to different degrees，and the recovery of group D was better than that of group C； （ 2） The results of HE coloration showed that new follicles appeared in all rats＇ovaries of group D； （ 3） The results of sex hormone detection showed that there were significant differences between E2 of each group（ P＜0． 01） ． Conclusion： AFS has repair functions on POF． AFS can promote the generation of follicles and can regulate the secretion of estrogen，thus can assist the functions of ovaries．
（ 第四军医大学西京医院妇产科，西安 710032）
【摘要】 目的： 尾静脉注射移植人羊水干细胞 （ AFS） ，评价其治疗大鼠卵巢早衰 （ POF） 的效果。方法： 采用 SD 大鼠，按体重随机分为四组： A 组正常组、B 组模型组、C 组 一次移植组和 D 组两次移植组，除 A 组灌胃生理盐水外，其余各组均连续 14 天灌胃雷公 藤多苷片； C 组在第 14 天灌胃后移植一次 AFS，D 组在第 1 天与第 7 天灌胃后移植两次 AFS； 观察大鼠阴道涂片、血清性激素水平、大鼠卵巢及子宫组织形态学变化。结果： （ 1） B 组动情周期较 A 组显著延长，C 组与 D 组均有不同程度恢复，D 组恢复状况优于 C 组； （ 2） HE 染色结果显示，D 组大鼠卵巢均有新生卵泡； （ 3） 性激素检测结果显示，各组之间 E2 值差异均有统计学意义（ P 均＜0． 01） 。结论： AFS 对 POF 有修复作用，可能通过促进 卵泡生成，调节雌激素分泌，从而改善了卵巢功能。
【Key words】 Amniotic fluid stem cell； Transplant treatment； Rats，sprague-dawley； Premature ovarian failure； Estradiol
卵巢早衰是指妇女青春期发育后 40 岁前发生 闭经、卵巢萎缩、体内雌激素水平低落、促性腺激素 水平高达绝经期水平的现象。发病机理为： 染色体 核型异常，卵泡生成障碍，自身免疫性卵巢衰竭，卵 细胞储备过少或耗竭过多。病理类型包括无卵泡型 和有卵泡型。无卵泡型患者染色体核型异常、卵巢
发育不全及皮质无卵泡。患者常需要少量的雌激 素，或雌、孕激素周期治疗，不但可消除更年期综合 征，而且可预防骨质疏松。
近年羊水多潜能干细胞 （ amniotic fluid-derived stem cell，AFS） 的发现为干细胞组织工程方面的研 究提供了新思路［1］。羊水取材简便，既可在产前诊
* 通讯作者 Email： gynob@ fmmu． edu． cn
将取出的血静置 15min 后，离心（ 2500r / min） 20min，取上清 液送检，用放免法测定血清性激素水平［促卵泡激素（ FSH） 、 雌二醇（ E2 ） ］。将固定于福尔马林中的卵巢和子宫石蜡包 埋，常规切片，HE 染色，光镜下观察大鼠卵巢和子宫形态学 变化。 1． 4 统计学处理 用 SPSS11． 5 软件处理数据，数据以 x珋±s 表示，两样本比较均采用 LSD 法检验，P＜0． 05 为差异有统计 学意义。
2结果 2． 1 羊水干细胞的形态及生物学性状 复苏培养 的羊水干细胞贴壁生长，细胞形态均一，为长梭形细 胞集落。传代细胞 12h 内完全贴壁，经过 1 ～ 2 天潜 伏期后倍增迅速，4 ～ 5 天可达 90% 融合，细胞呈漩 涡状、辐射状排列，细胞之间界限不清，细胞倍增时 间约 36h。见图 1。 2． 2 阴道涂片检查结果 见表 1。4 组的动情周期 两两比较差异均有统计学意义（ P 均＜0． 05） 。B 组 （ 模型组） 动情周期较 A 组延长； C 组（ 一次移植组） 动情周期较 B 组好转； D 组（ 二次移植组） 动情周期 治疗效果优于 C 组。光镜下可见大而无核的角化 细胞占绝大多数计为动情期。见图 2。
组别
A组 B组 C组 D组
Leabharlann Baidu
表 1 各组大鼠动情周期天数比较（ x珋±s）
处理
样本含量（ n） 动情周期（ d）
自由饮水 雷公藤造模 1 次注射 AFS 2 次注射 AFS
8
4． 23±0． 69
8
7． 33±0． 72
8
6． 52±0． 98
8
5． 17±0． 93
2． 3 性激素水平检测结果 见表 2。分析表明，四 组的 FSH、E2 两两比较，差异均有显著统计学意义 （ P 均＜0． 01） 。B 组造模成功，C、D 两组尾静脉注 射移植羊水干细胞后均有明显的治疗效果，而且 D 组治疗效果更明显。
Preliminary study on the effects of human amniotic fluid-derived stem cells on rats＇premature ovarian failure． Li Jie，Zhang Jianfang，Bai Lu，et al． Department of Gynecology and Obstetrics，Xijing Hospital，Fourth Military Medical University，Xi＇an 710032
DOI:10.13283/j.cnki.xdfckjz.2012.02.003
现代妇产科进展 2012 年 2 月第 21 卷第 2 期 Prog Obstet Gynecol，Feb． 2012，Vol. 21，No. 2
·论著·
人羊水来源干细胞治疗大鼠卵巢早衰的初步研究
李 洁，张建芳，白 璐，陈必良*
116
现代妇产科进展 2012 年 2 月第 21 卷第 2 期 Prog Obstet Gynecol，Feb． 2012，Vol. 21，No. 2
断时经羊膜穿刺获取，也可在分娩过程中收集。不 会对母亲和胎儿造成伤害，安全性高，而且不涉及伦 理道德问题［2］。本实验室采用贴壁法分离、多次传 代扩增方法获得羊水干细胞。获得的羊水干细胞表 达胚胎干细胞表面标志和间充质干细胞表面标志， 不表达造血干细胞表面标志。实验验证了羊水干细 胞的分化潜能，在神经诱导基、成骨诱导基、成脂诱 导基培养条件下，羊水干细胞在体外可以分化出神 经细胞、成 骨 细 胞 和 脂 肪 细 胞。本 实 验 旨 在 研 究 AFS 在细胞治疗方面的作用，探讨其用于治疗卵巢 早衰的可能性。实验获得第四军医大学西京医院伦 理委员会批准。 1 材料与方法
1． 1 材料来源 SD 大鼠： 12 周龄，健康，雌性，体重 250 ～ 270g，由第四军医大学动物实验中心提供。隔日换垫料，自 由饮食，室温控制在 25℃ ，湿度 70% ，通风良好。入组标准： 动物购入后适应性喂养 2 ～ 3 天，连续 5 ～ 10 天做阴道涂片， 有动情周期的大鼠纳入实验组。标准混合饲料由第四军医 大学动物实验中心提供。 1． 2 主要试剂与仪器 T104 羊水细胞培养基（ Irvine Scientific 公司） ，胰 蛋 白 酶、EDTA、DMEM、胎 牛 血 清 （ Gibco 公 司） ，雷公藤多苷片（ 湖南协力） ，载玻片（ 深圳康乃馨生物） ； HE 染色剂（ 北京安柏定） ； 离心机（ Saitexiangyi TDSA-WS） 。 1． 3 实验方法 1． 3． 1 羊水干细胞培养 复苏来源于第四军医大学妇产科 实验室的羊水干细胞，此羊水取自妊娠 16 ～ 22 周行产前遗 传学诊断的健 康 孕 妇，取 标 本 前 均 征 得 孕 妇 本 人 及 家 属 同 意。将干细胞接种于培养瓶，加入 T104 培养基（ 含 1% 青霉 素 / 链霉素） ，置饱和湿度、37℃ 、5% CO2 培养箱中培养。此 后每 2 ～ 3 天 换 液，至 80% 细 胞 融 合 时 以 0． 25% 胰 酶 + 0． 02% EDTA 消化细胞，按 1 ∶ 3 传代。 1． 3． 2 动物卵巢早衰模型的制备 适应性喂养后，大鼠按 体重随机分为 4 组，A 组： 正常对照组，B 组： 模型组，C 组： AFS 一次移植组，D 组： AFS 两次移植组。研碎雷公藤多苷 片后，用三蒸水溶化配药。除 A 组外，其余各组大鼠于晨 9 时灌雷公藤多苷片 50mg / （ kg·d） ，每日 1 次，连续灌胃 14 天［3］。 1． 3． 3 移植方法 C 组于第 14 天以尾静脉注射方式每只 大鼠一次性移植 2 ×106 P8 AFS，D 组分别于第 1 天和第 7 天 以尾静脉注射方式每只大鼠移植共 2×106 P8 AFS，AFS 以 1ml BS 悬匀。 1． 3． 4 处理方法 各组大鼠均于末次灌药后一周处死，处 死前禁食 4h 并称量大鼠体重，经腹主动脉取血，留取血标本 测定相关指标并处死大鼠，剖腹取卵巢和子宫，置于中性福 尔马林液固定。 1． 3． 5 观测指标 实验结束前 10 天开始将各组大鼠阴道 涂片，每日 1 次，连涂 10 天，观察比较各组大鼠动情周期。
【Abstract】 Objective： To evaluate its the treatment effects on rats＇premature ovarian failure． With transplant human amniotic fluid-derived stem cells by caudal vein injection，Methods： SD rats were randomly divided into four groups by weight： group A（ normal group） ，group B（ model group） ，group C（ once transplantation group） ，group D（ twice transplantation group） ． Except group A was perfused with physiological saline，other groups were perfused with Tripterygium Glucosides tablet for 14 days； then group C transplanted AFS once on the 14th day after gastric perfusion，group D transplanted AFS twice on the 1st day and the 7th day after gastric perfusion． Rat＇s vaginal smears，serum sex hormone levels and the morphological changes of rats＇ovary organizations were observed． Results： The treatment effects of AFS on Rats＇premature ovarian failure： （ 1） The estrous cycle of group B was significantly prolonger than that of group A． Both group C and group D recovered to different degrees，and the recovery of group D was better than that of group C； （ 2） The results of HE coloration showed that new follicles appeared in all rats＇ovaries of group D； （ 3） The results of sex hormone detection showed that there were significant differences between E2 of each group（ P＜0． 01） ． Conclusion： AFS has repair functions on POF． AFS can promote the generation of follicles and can regulate the secretion of estrogen，thus can assist the functions of ovaries．
（ 第四军医大学西京医院妇产科，西安 710032）
【摘要】 目的： 尾静脉注射移植人羊水干细胞 （ AFS） ，评价其治疗大鼠卵巢早衰 （ POF） 的效果。方法： 采用 SD 大鼠，按体重随机分为四组： A 组正常组、B 组模型组、C 组 一次移植组和 D 组两次移植组，除 A 组灌胃生理盐水外，其余各组均连续 14 天灌胃雷公 藤多苷片； C 组在第 14 天灌胃后移植一次 AFS，D 组在第 1 天与第 7 天灌胃后移植两次 AFS； 观察大鼠阴道涂片、血清性激素水平、大鼠卵巢及子宫组织形态学变化。结果： （ 1） B 组动情周期较 A 组显著延长，C 组与 D 组均有不同程度恢复，D 组恢复状况优于 C 组； （ 2） HE 染色结果显示，D 组大鼠卵巢均有新生卵泡； （ 3） 性激素检测结果显示，各组之间 E2 值差异均有统计学意义（ P 均＜0． 01） 。结论： AFS 对 POF 有修复作用，可能通过促进 卵泡生成，调节雌激素分泌，从而改善了卵巢功能。
【Key words】 Amniotic fluid stem cell； Transplant treatment； Rats，sprague-dawley； Premature ovarian failure； Estradiol
卵巢早衰是指妇女青春期发育后 40 岁前发生 闭经、卵巢萎缩、体内雌激素水平低落、促性腺激素 水平高达绝经期水平的现象。发病机理为： 染色体 核型异常，卵泡生成障碍，自身免疫性卵巢衰竭，卵 细胞储备过少或耗竭过多。病理类型包括无卵泡型 和有卵泡型。无卵泡型患者染色体核型异常、卵巢
发育不全及皮质无卵泡。患者常需要少量的雌激 素，或雌、孕激素周期治疗，不但可消除更年期综合 征，而且可预防骨质疏松。
近年羊水多潜能干细胞 （ amniotic fluid-derived stem cell，AFS） 的发现为干细胞组织工程方面的研 究提供了新思路［1］。羊水取材简便，既可在产前诊
* 通讯作者 Email： gynob@ fmmu． edu． cn
将取出的血静置 15min 后，离心（ 2500r / min） 20min，取上清 液送检，用放免法测定血清性激素水平［促卵泡激素（ FSH） 、 雌二醇（ E2 ） ］。将固定于福尔马林中的卵巢和子宫石蜡包 埋，常规切片，HE 染色，光镜下观察大鼠卵巢和子宫形态学 变化。 1． 4 统计学处理 用 SPSS11． 5 软件处理数据，数据以 x珋±s 表示，两样本比较均采用 LSD 法检验，P＜0． 05 为差异有统计 学意义。
2结果 2． 1 羊水干细胞的形态及生物学性状 复苏培养 的羊水干细胞贴壁生长，细胞形态均一，为长梭形细 胞集落。传代细胞 12h 内完全贴壁，经过 1 ～ 2 天潜 伏期后倍增迅速，4 ～ 5 天可达 90% 融合，细胞呈漩 涡状、辐射状排列，细胞之间界限不清，细胞倍增时 间约 36h。见图 1。 2． 2 阴道涂片检查结果 见表 1。4 组的动情周期 两两比较差异均有统计学意义（ P 均＜0． 05） 。B 组 （ 模型组） 动情周期较 A 组延长； C 组（ 一次移植组） 动情周期较 B 组好转； D 组（ 二次移植组） 动情周期 治疗效果优于 C 组。光镜下可见大而无核的角化 细胞占绝大多数计为动情期。见图 2。
组别
A组 B组 C组 D组
Leabharlann Baidu
表 1 各组大鼠动情周期天数比较（ x珋±s）
处理
样本含量（ n） 动情周期（ d）
自由饮水 雷公藤造模 1 次注射 AFS 2 次注射 AFS
8
4． 23±0． 69
8
7． 33±0． 72
8
6． 52±0． 98
8
5． 17±0． 93
2． 3 性激素水平检测结果 见表 2。分析表明，四 组的 FSH、E2 两两比较，差异均有显著统计学意义 （ P 均＜0． 01） 。B 组造模成功，C、D 两组尾静脉注 射移植羊水干细胞后均有明显的治疗效果，而且 D 组治疗效果更明显。