免疫组化

免疫细胞化学阳性结果定位分布
3.细胞核阳性
C-fos+ in nucleus
免疫细胞化学阳性结果定位分布
4.复合型： 核+胞浆阳性
注意：固定不及时，前处理过度 可以造成假阳性
免疫细胞化学阳性结果定位分布
5.微绒毛型
甲状腺、胃肠、胆管、卵巢腺癌的微绒毛 如上皮膜抗原
免疫组化阳性结果定位分布
1.局灶型
4）Reagent concentration is too high or invalid 试剂浓度过高或失效。
未封闭内源性过氧化物酶
胃固有膜腺体
3．假阴性反应：
⑴ 组织固定不当或固定时间过长； ⑵ 抗体效价过低或久置失效； ⑶ 组织中抗原被粘稠基质或分泌物阻隔；
⑷ DAB或H2O2的浓度不当。
４．内皮细胞肿瘤及其标记物：血管内皮肉瘤
⑴ 第Ⅷ因子相关抗原（Factor Ⅷ-related Antigen,Ｆ８）
⑵ 荆豆凝集素（Ulex Europaeus－1 Lectin,ＵＥＡ－
１）； ⑶ ＢＭＡ２００、ＣＤ３１、ＣＤ３４等。
５．骨、软骨和脂肪组织肿瘤及其标记物： ⑴ Ｓ－１００，Vimentin阳性； ⑵ Lysozyme少数阳性。
2. 片块型
3. 弥漫型 4. 网状型 5. 腺管型 6. 腔缘型 7. 菊团型
免疫组化阳性结果强度
Ⅰ
< 25%
Ⅱ 25~50%
Ⅲ 50~75% Ⅳ > 75%
四．免疫组织化学染色过程中需注意的有关事项
１．正确设置免疫组织化学的对照
对照原则：首先对照第一抗体；替代对照要注意相同的原 则；阳性结果阴性对照，阴性结果阳性对照；染色清晰， 定位准确。 阴性对照：
三．常用免疫组织化学染色方法
（一）直接法 • 将荧光素(免疫荧光法)或酶直接标记在第 一抗体上，以检查相应的抗原。直接法 具有特异性强的优点，但敏感性差，耗 费抗体多。
（二）间接法
先用荧光素或酶标记第二抗体，一抗为特异
性抗体， 二抗仅有种族特异性。
特点: ⑴ 预先标好二抗，较方便；
⑵ 比直接法敏感，但仍差。
免疫组化
苏 敏
汕大医学院病理国家重点学科
一、原理与方法
免 疫 组 织 与 细 胞 化 学 检 查 （ Immunohistochemistry and
immunocytochemistry examination）是利用免疫学原理，将抗原抗体
反应应用与组织细胞化学而进一步通过级连放大，增加敏感性。最后用辣 根过氧化物酶显色。从而定位组织细胞中抗原（蛋白 多肽、酶）等多种
2．间叶组织（软组织）及其肿瘤标记物：
（１）间叶源性肿瘤：波形蛋白（Vimentin）；
（２）纤维组织源性肿瘤：纤维瘤、肉瘤，恶纤组。 ① 抗胰蛋白酶（α1—ＡＴ，ＡＡＴ）； ② 抗胰糜蛋白酶（α—ＡＣＴ，ＡＣＴ）； ③ 溶菌酶（Lysozyme）。
3．肌细胞及肌上皮肿瘤及其标记物：肌瘤、肌肉瘤、
• 免疫组织化学最突出的优点是能在微观世界原位地确 定组织及细胞结构的化学成分
• 由于其方法简便且可重复性强，目前已得到广泛的应
用，并正继续向着更微细、更精确的原位分子杂交和 免疫电镜方向发展，向着分子病理学的领域推进。
细胞角蛋白
胃腺癌
送检（肉眼）：“胃体”部分胃壁切除标本，15 × 6×5cm ，切开见1个圆形肿物， 大小10.5×6 ×5cm，切面灰白、质地稍硬。
Wu Ming-Yao et al.
GFAP+ in cytoplasm of neuroglia cell. Tian Dong-Ping, Su Min et al.
Fos+ in nucleus
尖锐湿疣
HPV
IHC ×200
郭 煜 2007
Ki67 MCM2
PCNA
原位癌
IHC×400
胡彬 2007
1）Non-specific
reaction (非特异性反应)：边缘现象、皱折和刀痕、出血
来自百度文库
和
坏死等 2）Endogenous peroxidase(内源性过氧化物酶}：红细胞、炎细胞、退变坏死细 胞 皮分泌物，以及某些富含过氧化物酶的组织，如脑、肝等； 3）Cross-reactive (交叉反应)：抗体本身含有与人体组织发生交叉反应的成分；
特点：⑴ 敏感性较高；
⑵ 背景染色低（相对）； ⑶ 双PAP敏感性更高，但背景相对较重。
（四）ABC法： 1981年美籍华人许世明发明了ABC法
Vector
既卵白素－生物素过氧化物酶复合物法(Avidin Biotin-peroxidase Complex,ABC) 利用卵白素与生物素特有的高度亲和力，先将生物素与酶结合形成生物 素化HRP，再以生物素化 HRP与卵白素按一定比例混合，形成一个复合 物；同时先将二抗生物素化。
。
免疫组化阳性结果色度
弱阳性： 淡黄色
中等阳性： 棕黄色 强阳性： 棕黑色 分布密度 方法灵敏度
取决于：抗原量
免疫细胞化学阳性结果定位分布
1.细胞膜阳性
E-cad + in membrane
Esophageal carcinoma
免疫细胞化学阳性结果定位分布
2. 细胞浆阳性：
GFAP+ in cytoplasm of neuroglia cell.
3．纯化抗体； 4．抗体标记组织切片； 5．染色反应； 6．观察结果。
（二）常用标记物
1．酶 为最常用的标记物。作为标记的酶应具有以下条件：① 底物是特异性的，且易于显示；②酶反应产物稳定，不易 扩散；③容易获得纯酶分子且较稳定；④酶标记抗体后， 不影响两者的活性；⑤被检组织中不应存在内源性相同的 酶或其底物。常用的标记酶有辣根过氧化物酶（ HRP ）、 硷性磷酸酶（AKP）、葡萄糖氧化酶（GOD）等。 2．荧光素 指在高能量光波的激发下能产生荧光的物质。常用 的有异硫氰酸荧光素（ FITC ）、四甲基异硫氰酸罗达明 （TRITC）。 3．生物素 其与卵白素的亲和力明显高于抗原抗体的结合力。 4．金属标记物 如铁蛋白和胶体金。多用于免疫电镜。
① 角蛋白多肽（如ＣＫ１９）；
② 组织多肽抗原（tissue polypeptide antigen,ＴＰＡ）； ③ 上皮细胞膜抗原（epithelial membrane antigen,ＥＭＡ）。
（３）选择性存在于某些上皮细胞内的标记物：
① 角蛋白多肽（ＣＫ１３），癌胚抗原（ＣＥＡ）； ② 甲胎蛋白（ＡＦＰ），乳铁蛋白（lecroferrin）； ③ 前列腺特异性抗原（ＰＳＡ）及激素类等。
肌上皮瘤。
⑴ 结蛋白（Desmin），最常用，肌细胞分化最早的标记； ⑵ 肌动蛋白（Actin），属肌丝蛋白，６种亚型分别存在于不同 的肌细胞、肌上皮细胞 ⑶ 肌球蛋白（Myosin），属肌丝蛋白，分Ⅰ型（慢）和Ⅱ型 （快）收缩纤维，存在于心肌、横纹肌及平滑肌中，肌动蛋白 和肌球蛋白均出现在肌细胞发育分化中期。 ⑷ 肌红蛋白（Myoglobin），是心肌和横纹肌结合氧的肌红蛋白， 存在于分化成熟的横纹肌中。
图8
图9
图10 免疫组化结果： 肿瘤细胞Vimentin（+）
图11免疫组化结果： 肿瘤细胞（CD117+）
抗原修复
从应用病理技术观点来看，福尔马林组织标本固定
术就像一把双刃剑：
福尔马林（10%甲醛溶液）是一经典的常规病理 诊断用组织样本固定剂，然而缺点是其对免疫组 织化学及原位杂交信号检测是有损害作用。
（１）空白对照：用ＰＢＳ置换第一抗体； （２）血清替代对照：用同种动物的正常血清代替第一抗体； （３）抑制对照：用未标记的抗体先和相应的抗原结合； （４）吸收对照：用纯化的抗原对抗体先行吸收； 阳性对照：用已知或已被实验证明为阳性的组织； 自身对照：利用组织切片内的各种不同的组织成分作对照。
2．假阳性反应：
8．淋巴造血组织肿瘤及其标记物：
(１)LCA（Leucocyte Common Antigen，白细胞共同抗原）；
(２)Ｌ２６、ＭＢ２、Ｋｉ－Ｂ３、４ＫＢ５－－标记Ｂ淋巴细胞；
(３)ＵＣＨＬ－１、ＭＴ１－－标记Ｔ淋巴细胞；
(４)ＭＡＣ３８７、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ－－标记组织细胞； (５)ＣＤ１５、ＣＤ３０（Ki-antigen）－－标记Ｒ－Ｓ细胞； (６)ＬｅｕＭ１－－标记单核细胞、粒细胞。
４通过一些反映细胞增殖和与肿瘤恶性程度有关的标记物协助识
别肿瘤的良恶性。
（二）各种不同组织及其肿瘤常见的标记物：
1．上皮组织及其肿瘤标记物： （１）存在于所有上皮细胞内的标记物：
① 桥粒蛋白（desmoplakin）
②细胞角蛋白（Cytokeratin,ＣＫ）：一种中间丝蛋白 （２）存在于大部分上皮细胞内的标记物：
抗原修复
福尔马林固定甲醛反应导致组织蛋白质发生的一系列反应， 最终导致蛋白质交联
这种特殊的蛋白质交联依赖于氨基酸侧链的参与
这种蛋白质交联可导致蛋白质变性，降低或丢失免疫活性
反应。
抗原修复
基因产物的特异方法。
在病理学外检工作中可用于对不同来源， HE难以诊断的的肿瘤进行确诊
和鉴别诊断。
其基本原理是应用抗原与抗体接触后可形成“抗原－抗体复合物”的化学 反应，以检测组织或细胞内抗原（或抗体）的技术。
Immunohistochemistry
Esophageal carcinoma E-cad + in membrane
9．神经及神经内分泌肿瘤及其标记物：
（１）胶质纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein, Ｇ ＦＡＰ）：胶质细胞、室管膜细胞； （２）髓鞘碱性蛋白（ＭＢＰ）：少枝细胞； （３）神经细胞烯醇化酶（ Neurun specific enolosa,ＮＳ Ｅ）：神经细胞； （４）神经微丝（Neurofilaments,ＮＦ）神经细胞、嗜铬细 胞、副节细胞、ＡＰＵＤ瘤； （５）嗜铬素Ａ（Chromogranin Ａ）：神经内分泌肿瘤。 （６）其它：ＡＣＴＨ、Calcitotin、Gastrin、Glucagon、 hGH、Insulin 、Serotonin等。
（三）PAP法与双PAP法：
既 过 氧 化 物 酶 抗 过 氧 化 物 酶 复 合 物 法 (Perixidase Antiperoxidase Complex Method,PAP) 先将过氧化物酶（ HRP）免疫兔 / 羊 /鼠，制成兔 /羊/鼠抗Ｈ ＲＰ；然后再与ＨＲＰ结合，形成一个稳定的多角形结构 （PAP）。
６．滑膜及间皮肿瘤及其标记物：双向分 化，无特异性标记物。
Keratin,EMA;Vimentin,FN,AAT,ACT,Lys
ozyme等均有可能阳性。
７．周围神经肿瘤及其标记物：
⑴ S-100：神经纤维肿瘤，神经鞘肿瘤。
⑵ 髓性缄性蛋白（Myelin basic protein,MBA）； ⑶ 髓鞘相关蛋白（MAG）； ⑷ 层粘连蛋白（Laminin）。
双标染色结果
左）Ii（ 200/400）
右）HLA-DR （ 200/400）
双标染色
Ii （ 400）
DR（ 400）
二、免疫组织化学技术的主要步骤与常用标 记物
（一）主要步骤
1．提取抗原(免疫原Immuno-gen);
2．用免疫原免疫动物 (兔)制备抗血清(多克隆抗体) 或免疫动 物(鼠)后，用杂交瘤技术制备单克隆抗体；
１．如将卵白素换成链霉亲和素，则为： ＳＡＢＣ法：(StreptAvidin Biotin-peroxidase Complex) ２．将链霉亲和素和生物素先连结起来，则称： ＬＳＡＢ法：labelled StreptAvidin-Biotin ３．用链霉素抗生物素蛋白连结辣根过氧化物酶，则为： Ｓ－Ｐ法：(StreptAvidin Peroxidase conjugataed method) 特点: ⑴ 敏感性高，（比ＰＡＰ高８～４０倍）； ⑵ 背景淡，链霉亲和素更好； ⑶ 方法较简便，时间较短； ⑷ 应用范围广，也可用于原位杂交和免疫电镜。
五、免疫组织化学在肿瘤诊断和鉴别诊断 中的应用
（一）在肿瘤诊断中应用免疫组织化学染色的原因：
１在常规病理活检中,通常有５～１０％的疑难病例不能明确诊断。
２形态结构相似的肿瘤可为不同的组织来源（如未分化癌和恶性 淋巴瘤）因而难于识别，给治疗带来困难。 ３一些转移性肿瘤常常缺乏特有的组织学特征，因而无法确定其 原发病灶（如甲状腺癌和前列腺癌）。