免疫组化技术规范
免疫组化各步原理
一、免疫组化技术免疫组织化学（Immunohistochemistry"HC）技术是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测技术。
目前，这种技术在临床病理诊断和形态学研究中已得到广泛应用。
Slide 3:（一）、免疫组化常用染色方法和步骤（石蜡切片）SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法）:SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法）原理采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及底物色素混合液来测定细胞和组织中的抗原。
主要步骤:主要步骤1、石蜡切片脱蜡（与常规HE切片脱蜡相同）：石蜡切片置60 ℃ 烤箱烤片15小时以上一从烤箱中拿出立即放入二甲苯I中5~10 min一二甲苯II 5~10min 一无水乙醇5min 一95%乙醇5min 一80%乙醇5min 一70%乙醇5min 一自来水洗Slide 6:2、3%H2O2阻断20min （以消除内源性过氧化物酶的活性，降低背景）；PBS 洗3次，每次5min。
3、抗原修复；PBS洗3次，每次5min。
4、滴加5~10% 正常山羊血清封闭，37℃, 10min （消除背景非特异性着色）Slide 7:5、吸干组织周围多余的血清，不洗，滴加第一抗体，37℃,孵育60min或孵育30min 再4℃冰箱过夜；PBS洗3次，每次5min。
6、擦干组织周围PBS, 滴加生物素标记的第二抗体，37c 孵育20min, PBS洗3次，每次5min。
Slide 8:7、擦干组织周围PBS,滴加链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液37c 孵育20min。
8、PBS洗3次，每次5min, D.W洗2次，DAB显色（DAB必须现用现配），镜下控制显色程度，自来水冲洗，苏木素复染胞核，烤干，中性树胶封片。
染色步骤:染色步骤石蜡切片脱蜡到水；3%H2O2阻断10min （以消除内源性过氧化物酶的活性，降低背景）；蒸馏水洗2次，PBS洗3次，每次5min。
her-2 免疫组化 评分标准
her-2 免疫组化评分标准全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：HER-2是一种重要的癌症标志物，广泛应用于乳腺癌和胃癌的免疫组化检测中。
HER-2（人类表皮生长因子受体-2）是一种膜上受体酪氨酸激酶，可以促进细胞生长和分化，参与细胞增殖和生存信号传导途径，其异常表达或过度表达与癌症的发生和发展密切相关。
在临床治疗中，HER-2免疫组化评分标准是一个重要的判断指标，通过对HER-2表达水平的评估，可以指导临床治疗方案的选择和预后的判断。
HER-2的免疫组化评分标准主要根据HER-2的膜表达强度和细胞膜的阳性率来进行分类评分。
主要有四个等级：0级、1级、2级和3级，具体标准如下：0级：不存在HER-2的膜表达，细胞膜完全阴性；1级：细胞膜显示很弱或微弱的不定性阳性；2级：细胞膜显示强阳性，疑似HER-2过表达；3级：细胞膜显示强烈阳性，明显HER-2过表达。
根据不同的评分结果，可以确定HER-2在肿瘤组织中的表达水平，从而为临床治疗方案的选择提供重要依据。
通常情况下，0级和1级的患者被认为是HER-2阴性，对HER-2靶向治疗药物无效；而2级和3级的患者则判定为HER-2阳性，可以考虑使用HER-2靶向药物进行治疗。
准确评估HER-2的表达水平对于个体化治疗方案的制定是至关重要的。
在进行HER-2免疫组化评分时，需要注意一些技术操作规范，以确保结果的准确性和可靠性。
必须选择合适的切片，并严格按照试剂盒说明书中的操作步骤进行染色和显微观察。
需要有经验的专业技术人员进行操作，确保染色结果清晰可靠。
在观察和评分过程中，要注意细胞膜的染色强度和阳性率，并结合组织学形态学特征进行分析和判断，避免评分的主观性和片子之间的差异性。
除了HER-2免疫组化评分标准外，还有其他方法可以用来检测HER-2的表达水平，例如原位杂交法、蛋白质芯片技术等。
这些方法都可以对HER-2的表达进行定量或定性分析，为临床治疗提供更多的参考依据。
hp判读免疫组化标准__概述说明以及解释
hp判读免疫组化标准概述说明以及解释1. 引言1.1 概述免疫组化标准是一种常见的生物医学技术，用于检测和评估组织样本中特定蛋白质的表达情况。
其中，hp判读免疫组化标准是一种基于免疫组化技术的分析方法，用于评估hp（high power）图像中蛋白质表达量及其相关性。
随着免疫组化技术在临床医学和生物医学研究中的广泛应用，hp判读免疫组化标准成为了对组织标本进行准确定量分析的重要手段之一。
通过hp判读，可以快速而准确地获取蛋白质表达信息，并据此为临床诊断和治疗决策提供依据。
1.2 研究背景在人类健康和疾病治疗上，蛋白质表达水平的变化往往与许多重要的生物过程以及肿瘤发展等密切相关。
因此，对于蛋白质表达量的准确测定和分析是非常关键的。
然而，在传统方法下观察和量化蛋白质表达往往存在一些局限性，如操作复杂、结果主观性较高等。
相比之下，hp判读免疫组化标准能够通过数字图像分析技术对hp图像进行定量评估，并提供客观、准确的结果。
1.3 目的本文的目的在于全面介绍和解释hp判读免疫组化标准的概念、原理和应用。
具体而言，我们将首先介绍hp判读方法的简要内容以及其在实际应用中的重要意义。
然后，我们会深入解析免疫组织化学基础知识，并描述标准标本处理流程。
此外，我们还将详细解释hp判读免疫组化标准评估过程中使用的参数及其含义，并对标星形象出现原因进行分析。
最后，通过实际应用案例分析，我们将展示hp判读在临床病例诊断和癌症筛查等方面的应用前景，并探讨其在生物医学研究领域中的可行性与潜力。
通过本文深入探讨hp判读免疫组化标准的相关内容，希望能为医学领域中对该技术感兴趣的研究人员和临床医生提供有益的参考和指导。
同时，也期望能为该技术的进一步发展提供思路和启示。
2. hp判读免疫组化标准概述2.1 hp判读方法简介hp判读是一种基于免疫组化技术的分析方法，用于评估特定标本中蛋白质的表达水平。
通过对组织或细胞中的特定抗原进行染色和观察，可以得出关于该抗原丰度和分布情况的信息。
文档：免疫组化技术规范
免疫组化技术规范欧美国家相继开展了免疫组化质量控制工作，建立了一套比较完善的质量控制方法和程序。
中国病理工作者委员会（CCP）免疫组化研究中心借鉴国外的先进经验并结合我国当前的实际情况开始探索一种适合我国免疫组化质控的方法，同时，发现和推广标准化的染色程序，改善和提高免疫组化实验的可靠性，使免疫组化技术更具标准化，免疫组化结果更具可靠性和重复性。
尽管免疫组化在许多实验室中已常规开展，但它是一个多步骤、多因素决定的一种实验方法，由于各实验室采用的修复方法、染色方法、试剂厂家、抗体克隆号、检测系统等有所不同，染色结果会出现较大差异，相当部分的实验室对免疫组化标准化的认识尚欠足够重视, 致使不良的染色结果对病理诊断引起误导，因此免疫组化染色结果的可靠性受到了极大的关注。
在实际工作当中有许多因素影响着免疫组化的结果，包括技术人员是否熟练掌握整个实验的操作程序、抗体的特异性、方法的敏感性、标本的固定、组织的处理、是否进行抗原修复、修复液的PH值等等因素。
为了让每个实验室能够持续稳定地完成可靠的实验染色结果，应当将免疫组化染色技术中的全部流程纳入标准化。
一、免疫组化成功的要素病理科医生要有相当的免疫组化诊断知识和免疫组化技术经验，要清楚认识免疫组化技术是一门实验性、技术性非常强的技术，要多了解多种抗体在组织中的表达情况，以及影响免疫组化结果的各种因素，只有提高医生的免疫组化诊断水平才能避免错误的判断，才能确保免疫组化诊断的准确性。
病理技术人员是免疫组化实验成功的关键因素，操作人员要有丰富的免疫组化的理论知识及熟练的免疫组化染色技术，十分清楚每一个步骤的应用原理，使实验结果更具可靠性。
可靠的实验试剂和实验方法是每个实验室的必备条件。
由于实验方法多种多样，抗体的品种繁多，每个实验室都应当确保高质量高效价的试剂，并摸索出最佳的实验条件。
优质的免疫组化取决于有效的抗原修复、敏感的检测系统、合适的实验质控对照及熟练和有责任心的技术人员。
XX医院免疫组化技术质量要求
免疫组化技术质量要求
免疫组化染色已经成为现代病理学中不可或缺的重要工具，准确的免疫组化染色极大地帮助病理诊断，或提供准确的分子治疗靶标；而不准确的免疫组化染色反而产生误导，造成误诊。
因此必须对影响免疫组化染色的各个环节进行严格的质控，对技术人员和病理医师进行培训，保证准确的染色结果和正确的结果判读。
1、免疫组化染色是特殊的技术，相关操作人员必须经过专门的培训。
2、每一批次的免疫组化染色必须设阳性和阴性对照，可利用组织中的内对照。
3、必须建立本实验室每种免疫组化染色的操作规程，并根据染色效果及时更新。
4、更换抗体或试剂后，需要用阳性和阴性组织对新试剂进行有效性验证，并有相应的文字记录和染色切片档案，相关档案保留2年。
5、免疫组化染色过程中产生的有毒液体（如DAB）应专门回收，严禁随处倾倒；
6、免疫组化制片要求在24小时内完成。
7、病理医师必须熟悉各种抗体染色结果，阳性信号表达部位、其诊断应用范围，以期做到正确的结果判读。
8、免疫组化染色结果必须由病理医师结合形态学综合判断，并将染色结果写到病理报告中。
- 2 -。
免疫组化的原理及操作规程
免疫组化的原理及操作规程免疫组化，即免疫组织化学染色技术，是一种利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（如荧光素、酶、金属离子、同位素等）显色，从而确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质）的定位、定性及相对定量的研究方法。
该技术广泛应用于临床病理诊断、生物医学研究以及药物开发等领域。
本文将详细介绍免疫组化的原理及操作规程。
一、免疫组化的原理免疫组化的基本原理是抗原与抗体的特异性结合。
抗原是指能够刺激机体产生免疫应答，并能与免疫应答产物（抗体或致敏淋巴细胞）发生特异性结合的物质。
抗体是机体的免疫细胞在抗原刺激下产生的具有特异性识别能力的免疫球蛋白。
在免疫组化中，通常将目标抗原（如某种蛋白质或多肽）作为待检测物，通过特定的抗体与之结合，再利用标记技术使抗体可视化，从而实现对目标抗原的定位、定性和定量研究。
免疫组化的标记技术主要有直接法和间接法两种。
直接法是将标记物（如荧光素、酶等）直接标记在抗体上，使其与目标抗原结合后直接显色。
间接法则是利用未标记的抗体（一抗）先与目标抗原结合，然后再通过标记的二抗（与一抗特异性结合的抗体）与一抗结合，最终实现显色。
间接法具有更高的灵敏度和灵活性，因此在实际应用中更为常见。
二、免疫组化的操作规程免疫组化的操作规程主要包括以下几个步骤：1. 标本处理：根据实验需求选择合适的组织标本，并进行固定、脱水、包埋等处理，制备成组织切片或细胞涂片。
固定是为了保持组织或细胞的形态结构，防止抗原丢失；脱水则是为了去除组织中的水分，便于后续操作；包埋则是将组织块包裹在支持物（如石蜡）中，便于切片。
2. 抗原修复：由于固定和脱水等处理过程可能导致抗原表位的遮蔽或改变，因此在进行免疫组化染色前，需要对抗原进行修复。
常用的修复方法包括热修复、酶修复和酸修复等。
具体方法应根据实验需求和抗原性质进行选择。
3. 阻断内源性酶活性：为了避免组织内源性酶对后续显色反应的干扰，需要使用相应的阻断剂（如过氧化氢）对内源性酶活性进行阻断。
atrx免疫组化和atrx基因金标准
ATRX免疫组化是指使用特定的抗ATRX抗体来检测细胞中ATRX蛋白的表达情况。
ATRX基因属于X染色体上的一个基因，它编码的是一种对铁离子敏感的ATP酶。
ATRX蛋白在细胞核中发挥着重要的作用，参与到染色质重塑、基因转录调控以及端粒的稳定等生物学过程中。
ATRX基因突变或缺失会导致染色质不稳定、端粒缩短以及肿瘤的发生。
通过ATRX免疫组化检测ATRX蛋白的表达情况可以帮助医生诊断肿瘤类型、评估肿瘤的预后以及制定个体化的治疗方案。
ATRX免疫组化是临床病理学中的一项重要检测技术，其结果对肿瘤的诊断和治疗具有重要的指导意义。
在进行ATRX免疫组化检测时，需要先准备组织切片，然后通过免疫组化技术使用特异性抗ATRX抗体对组织切片中的ATRX蛋白进行染色。
通过显微镜观察染色结果，可以判断出组织中ATRX蛋白的表达水平，进而对肿瘤进行分型和病理评价。
ATRX免疫组化技术的准确性和可靠性在肿瘤病理学领域得到了广泛认可，成为肿瘤诊断和治疗中不可或缺的一部分。
ATRX基因突变与多种肿瘤的发生和发展密切相关。
研究表明，ATRX 基因的突变或缺失在神经胶质瘤、睾丸生殖细胞瘤、胶质母细胞瘤等多种恶性肿瘤中均有发现。
根据ATRX免疫组化结果，可对这些肿瘤进行准确的分型和病理评价，有助于临床医生进行个体化治疗方案的制定。
ATRX免疫组化在某些先天遗传病和白血病等疾病中也具有重要的应用价值。
ATRX免疫组化技术的发展和应用，对于改善肿瘤患者的诊断和治疗效果具有重要意义。
在进行ATRX免疫组化检测时，需要注意以下几个方面：1. 样本的准备：组织切片应该保存完整，没有明显的脱落或破损，这样才能保证染色结果的准确性。
2. 抗体的选择：选择特异性抗ATRX抗体进行染色，以保证结果的准确性和可靠性。
3. 染色结果的解读：根据染色结果，判断组织中ATRX蛋白的表达水平，进而对肿瘤进行病理学评价和分型。
ATRX免疫组化作为一种重要的肿瘤诊断技术，对肿瘤的分类、预后评估和个体化治疗方案的制定具有重要的指导意义。
免疫组化
免疫组织化学技术制片的规范和质量控制随着免疫组织化学技术的不断发展，该技术在组织学研究和病理诊断尤其是在肿瘤鉴别诊断的应用越来越广泛。
科学地规范免疫组化技术的操作对保证免疫组化制片质量，提高临床病理诊断水平，促进病理学研究工作的发展有着重要的意义。
影响免疫组化染色结果的因素很多，除了免疫组化染色操作因素外，还包括组织切片制备各个环节的因素。
因此，免疫组化技术的操作规范也要包括组织切片技术的规范。
一、免疫组织化学技术对组织切片的要求免疫组织化学技术适用于冰冻切片和石蜡切片，部分抗体只能用于冰冻切片，大部分抗体可用于石蜡切片，适用于石蜡切片的抗体也适用于冰冻切片。
冰冻切片能很好地保存组织抗原，抗原丢失少，但形态结构差，定位不很清晰；石蜡切片组织形态结构好，定位清晰，但在组织的固定、脱水、包埋等过程中容易破坏组织抗原，使抗原的免疫活性有所降低。
因此在检测石蜡切片组织抗原时，尽可能保存组织抗原的免疫活性十分重要。
二、组织的固定组织离体以后应及时取材固定，组织经过固定后可保存组织原有的形态结构，防止组织抗原弥散。
常用的固定液为10％福尔马林液(4%甲醛液)，最好选用10％中性福尔马林液，固定时间为4-6小时，一般不超过24小时。
固定时间不足，组织结构不佳，组织抗原弥散；固定时间过长，可封闭或破坏组织抗原。
冰冻切片常用的固定液为无水丙酮或4%多聚甲醛，固定时间为10-20min。
三、载玻片的处理组织切片贴在载玻片上进行免疫组织化学染色，由于染色过程操作步骤及冲洗次数较多，容易出现脱片现象，因此将载玻片涂胶或硅化是必要的。
较常用效果较好的是硅化玻片。
硅化玻片的制备：1. 载玻片经酸洗，冲洗干净后烤干。
2. 2％APES丙酮溶液浸1-2min。
3. 无水丙酮液浸1-2min。
3. 蒸馏水浸洗1-2min。
4. 烤干备用。
可用无水酒精代替无水丙酮，也可以直接配成APES水溶液使用。
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免疫组化标准
免疫组化标准
免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）是一种常用于诊断和研究的技术，用于检测细胞和组织中特定抗原的存在和定位。
在免疫组化中，标准化是非常重要的，以确保结果的准确性和可重复性。
免疫组化标准通常包括以下几个方面：
1. 抗体选择：根据研究或诊断的需要选择合适的抗体，并确保抗体具备高度特异性和敏感性，以避免非特异性或假阳性的结果。
2. 样本处理和预处理：对组织样本进行固定、切片和染色前的预处理非常重要。
标准化的预处理步骤包括脱水、脱脂、抗原恢复和阻断非特异性结合。
3. 正确的染色程序：免疫组化染色的步骤包括抗原恢复、阻断非特异性结合、一抗孵育、二抗孵育、显色和染色核红剂。
每个步骤的时间和温度都需要严格控制，以确保可重复性和一致性。
4. 阴性和阳性对照：标准化的免疫组化需要包括阴性和阳性对照样本。
阴性对照样本是未表达目标抗原的组织或细胞，阳性对照样本是已知表达目标抗原的组织或细胞。
这些对照样本可以用来验证染色方法的准确性和可靠性。
5. 标准化的评估和解释：标准化免疫组化的结果需要由经验丰
富的病理学家或研究人员进行评估和解释。
对于定量分析，可以使用计算机图像分析软件来标准化评估和解释结果。
总之，免疫组化的标准化是确保结果准确和可重复的关键步骤。
只有遵循标准化程序和步骤，才能获得可信赖的免疫组化结果。
病理科免疫组化技术规范制度及流程
病理科免疫组化技术规范制度及流程下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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免疫组化操作规程
免疫组化操作规程
《免疫组化操作规程》
免疫组化（Immunohistochemistry, IHC）是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断中的技术，其操作规程的严谨性和标准化对于获得准确可靠的结果至关重要。
下面是一份免疫组化操作规程供参考：
1. 样本处理：将组织标本固定在适当的条件下，然后进行蜡包埋并切片。
注意保护好标本的完整性和质量。
2. 抗原修复：对标本进行适当的热处理或酶处理，以修复由于固定等步骤导致的抗原构象变化。
3. 抗体选择：选择适当的一抗和二抗，确保一抗的特异性和敏感性，二抗的来源和标记物的稳定性。
4. 标本处理：将切片标本进行脱脂、脱水和透明化处理，确保标本的透明度和形态保持完好。
5. 抗体染色：将标本与一抗和二抗分别反应，通过荧光标记或酶标记来检测靶标记的位置和强度。
6. 阅读结果：采用专业显微镜观察标本的染色结果，进行定量分析或者定性分析。
7. 结果验证：通过对照组和阳性对照进行染色结果的验证，确
保结果的准确性。
8. 结果分析：根据染色结果和临床信息进行综合分析，作出科学可靠的结论。
以上是一份免疫组化操作规程的基本内容，但在实际操作中还需要根据具体的实验室条件和要求进行进一步的细化和规范化。
希望这份规程能为从事免疫组化工作的科研人员和临床检验人员提供一些帮助。
免疫组化 样本制备
免疫组化样本制备
免疫组化（immunohistochemistry，IHC）是一种用来检测组织或细胞中特定蛋白质表达的技术。
样本制备是免疫组化中非常重要
的一步，下面我将从多个角度来介绍免疫组化样本制备的相关内容。
首先，样本的固定是样本制备的第一步。
通常使用的固定剂包
括乙醇、乙醛和甲醛等。
固定的目的是保持样本的形态结构，防止
蛋白质降解，并使得细胞膜通透性增加以利于抗体的渗透。
其次，样本需要进行脱水和包埋。
脱水是将样本中的水分逐渐
替换为透明剂，最常用的透明剂是己烷和乙醇。
脱水后，样本需要
被包埋在蜡块中，以保持其形态并便于切片。
接着，样本需要进行切片。
使用微波或酶解等方法使得蜡包埋
的组织变软，然后用切片机将其切成较薄的切片，通常厚度在3-5
微米之间。
然后，切片的脱脂和再水化。
切片需要经过蜡的脱脂和逆脱水
处理，使得切片中的蜡被去除，然后再将其重新水化。
最后，进行抗原修复。
抗原修复是为了使得样本中的蛋白质抗原更容易被抗体识别，通常使用高温和高压的方法进行抗原修复处理。
在免疫组化的样本制备过程中，以上步骤是非常关键的。
每一步都需要严格控制，以确保最终的免疫组化结果准确可靠。
同时，不同类型的样本可能需要针对性的处理方法，以保证最佳的实验效果。
希望这些信息能够对你有所帮助。
免疫组化实验流程审批
免疫组化实验流程审批免疫组化实验是一种常用的生物学和医学研究技术，它对于疾病的诊断、治疗和研究具有重要意义。
为了确保实验的准确性、可靠性和安全性，需要建立一套严格的实验流程审批制度。
一、免疫组化实验的基本原理和应用免疫组化实验基于抗原与抗体特异性结合的原理。
通过将特定的抗体与组织或细胞中的抗原结合，再利用显色反应或荧光标记等方法，使抗原所在的位置得以显示。
这一技术广泛应用于肿瘤诊断、病理学研究、神经科学、免疫学等领域。
在肿瘤诊断中，免疫组化可以帮助确定肿瘤的类型、来源、分化程度以及预测肿瘤的预后和对治疗的反应。
例如，乳腺癌中雌激素受体、孕激素受体和HER2 的检测，对于治疗方案的选择具有重要指导意义。
二、实验前的准备工作1、实验人员资质从事免疫组化实验的人员应具备相关的专业知识和技能，经过系统的培训，并熟悉实验室的安全操作规范。
实验人员需要了解免疫组化的基本原理、实验步骤、常见问题及解决方法。
2、实验材料和试剂选择合适的组织样本、抗体、显色剂等实验材料和试剂至关重要。
组织样本应保证新鲜、固定良好，并经过正确的处理和保存。
抗体的选择应根据实验目的和样本类型，确保其特异性和亲和力。
显色剂应具有良好的稳定性和显色效果。
3、实验设备和仪器准备齐全且性能良好的实验设备和仪器，如切片机、孵育箱、显微镜等。
设备应定期进行维护和校准，以保证实验结果的准确性和可靠性。
三、免疫组化实验流程1、组织样本处理（1）取材：从生物体中获取组织样本时，应遵循无菌操作原则，避免样本受到污染。
（2）固定：将组织样本迅速放入适当的固定液中，如福尔马林，以保持组织的形态和结构。
（3）脱水：通过梯度酒精脱水，去除组织中的水分。
（4）包埋：将脱水后的组织样本包埋在石蜡中，便于切片。
2、切片制作使用切片机将包埋好的组织切成薄切片，通常厚度为 4-6 微米。
切片应平整、完整，无褶皱和裂痕。
3、脱蜡和水化将切片放入二甲苯中脱蜡，然后依次经过梯度酒精进行水化。
免疫组化手工操作及方法
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• 市售抗体的种类
–某些抗体既有多克隆抗体也有单克隆抗体，如角蛋白， 一些抗原只有多克隆抗体，如α-胰蛋白酶
–有些抗体的抗原来自动物，利用动物与人抗原之间的共 同抗原性使该种抗体能应用于人的检测。如Desmin来源 于鸡的肌肉Biblioteka 非特异性背景着色原因及对策
电荷吸附
加二抗动物非 免疫血清
牛血清也常用
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假阴性的原因分析及对策
• 抗原的丢失 – 标本固定不及时、固定过久，浸蜡时间、温度过高，均可 将抗原性破坏
• 抗原的遮蔽 – 福尔马林固定石蜡包埋后，其抗原性因分子交联而被遮蔽 – 修复抗原，包括蛋白酶消化、微波加热处理
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异常着色原因及对策
•
切片制作不当
严重变性坏死及炎性病 灶处
切片裱贴不平
褶皱处
组织边缘部
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异常着色原因及对策
•
清洗不充分
用含盐的缓冲液充分冲
洗，可利于减低背景着 色
DAB显色产 生背景着色
未除去DAB的不溶性颗 粒
DAB保存不妥，其氧化 产物沉淀在组织上
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• 6. 取出容器，用自来水冲洗不锈钢锅外壁，加速冷却至室
温（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能
够恢复原有的空间构型）。
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• 7. 蒸馏水冲洗3分钟x3次
• 8. 用PBS溶液冲洗3分钟x3次
• 9. 除去PBS溶液
• 10. 3%H2O2室温孵育10分钟，以消除内源性过氧化物酶 的活性。
免疫组化技术规范
免疫组化技术规范欧美国家相继开展了免疫组化质量控制工作，建立了一套比较完善的质量控制方法和程序。
中国病理工作者委员会（CCP）免疫组化研究中心借鉴国外的先进经验并结合我国当前的实际情况开始探索一种适合我国免疫组化质控的方法，同时，发现和推广标准化的染色程序，改善和提高免疫组化实验的可靠性，使免疫组化技术更具标准化，免疫组化结果更具可靠性和重复性。
尽管免疫组化在许多实验室中已常规开展，但它是一个多步骤、多因素决定的一种实验方法，由于各实验室采用的修复方法、染色方法、试剂厂家、抗体克隆号、检测系统等有所不同，染色结果会出现较大差异，相当部分的实验室对免疫组化标准化的认识尚欠足够重视, 致使不良的染色结果对病理诊断引起误导，因此免疫组化染色结果的可靠性受到了极大的关注。
在实际工作当中有许多因素影响着免疫组化的结果，包括技术人员是否熟练掌握整个实验的操作程序、抗体的特异性、方法的敏感性、标本的固定、组织的处理、是否进行抗原修复、修复液的PH值等等因素。
为了让每个实验室能够持续稳定地完成可靠的实验染色结果，应当将免疫组化染色技术中的全部流程纳入标准化。
一、免疫组化成功的要素病理科医生要有相当的免疫组化诊断知识和免疫组化技术经验，要清楚认识免疫组化技术是一门实验性、技术性非常强的技术，要多了解多种抗体在组织中的表达情况，以及影响免疫组化结果的各种因素，只有提高医生的免疫组化诊断水平才能避免错误的判断，才能确保免疫组化诊断的准确性。
病理技术人员是免疫组化实验成功的关键因素，操作人员要有丰富的免疫组化的理论知识及熟练的免疫组化染色技术，十分清楚每一个步骤的应用原理，使实验结果更具可靠性。
可靠的实验试剂和实验方法是每个实验室的必备条件。
由于实验方法多种多样，抗体的品种繁多，每个实验室都应当确保高质量高效价的试剂，并摸索出最佳的实验条件。
优质的免疫组化取决于有效的抗原修复、敏感的检测系统、合适的实验质控对照及熟练和有责任心的技术人员。
免疫组化实验注意事项
免疫组化实验注意事项
1.实验前要注意仪器和试剂的准备，确保实验所需的材料完整、干净，无污染。
2.实验过程中要注意实验操作的无菌技术，避免细菌和其他微
生物的污染。
3.实验人员需要佩戴实验服和手套，以防止实验样品的污染和
交叉污染。
4.实验室环境要保持干净整洁，避免灰尘和其他杂物的干扰。
5.实验人员要掌握实验步骤和操作技巧，确保实验操作的准确
性和可重复性。
6.实验过程中要严格遵守实验室安全操作规范，使用化学品时
要戴好防护眼镜和口罩，避免化学品溅到皮肤。
7.实验样品的处理要妥善，及时清理实验台和实验仪器，避免
污染和交叉污染。
8.实验结果的解读要谨慎，需要参考相关文献和实验室经验，
避免误判和错误结论。
9.实验数据要及时记录和整理，确保实验结果的可靠性和可复
制性。
10.实验完后要将实验台和实验仪器清洗干净，归位整理，确保实验室的卫生和安全。
一张好的免疫组化切片判断标准
一张好的免疫组化切片判断标准一、引言在现代医学领域，免疫组化技术是一种用来检测组织或细胞中特定蛋白质的方法。
免疫组化切片是在临床病理诊断和科学研究中广泛应用的重要技术之一。
通过观察组织或细胞中特定蛋白质的表达情况，医生可以帮助诊断疾病、判断肿瘤的类型和预后，并指导治疗方案的制定。
然而，要准确判断一张好的免疫组化切片，需要符合一系列严格的标准和要求。
本文将从深度和广度两方面对一张好的免疫组化切片判断标准进行全面评估，并探讨其重要性和挑战。
二、深度评估1. 样本质量一张好的免疫组化切片首先要求样本的质量优良。
只有样本质量良好，才能确保切片的可靠性和可比性。
对组织样本的获取、固定、包埋和切片等操作必须严格规范，确保样本完整、清晰无污染。
2. 标记抗体的选择免疫组化切片的质量很大程度上取决于使用的标记抗体。
优质的抗体具有较高的特异性和灵敏度，能够准确地检测组织或细胞中目标蛋白的表达情况。
在进行免疫组化实验时，需要仔细选择合适的抗体，并进行严格的验证实验。
3. 良好的显色和染色良好的显色和染色是判断一张好的免疫组化切片的重要指标。
合适的染色时间、显色剂和显微镜下的观察条件都会直接影响切片的质量。
只有进行适当的染色操作，才能保证图像清晰、对比度适当，便于医生进行判断和诊断。
4. 数据分析和解读正确的数据分析和解读是判断一张好的免疫组化切片的关键。
医生需要准确地识别和分析切片中的阳性和阴性信号，评估蛋白质的表达水平，并结合临床信息进行综合判断。
医生需要具备扎实的专业知识和丰富的实践经验。
三、广度评估1. 标准化操作流程为了确保免疫组化切片的一致性和可比性，在临床实验室中需要建立标准化的操作流程。
从样本处理、抗体选择、染色操作到数据分析，每个环节都需要严格按照标准程序进行操作，避免人为差异的干扰。
2. 质量控制与质量保证免疫组化切片作为临床诊断和研究中的重要辅助手段，其质量的保证至关重要。
实验室需要建立严格的质量控制体系，监测各个环节的质量，及时发现和处理异常情况，保证切片的质量稳定可靠。
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6．检测系统：通用的检测系统有生物素标记的ABC、SP、LSAB等，此类检测系统较为经济，日前仍有不少医院在使用。非生物素类检测系统价钱较贵，由于不需通过生物素的结合，可以避免内源性生物素的干扰，其特点：敏感、省时、方便、背景低。
一、 免疫组化成功的要素
病理科医生要有相当的免疫组化诊断知识和免疫组化技术经验，要清楚认识免疫组化技术是一门实验性、技术性非常强的技术，要多了解多种抗体在组织中的表达情况，以及影响免疫组化结果的各种因素，只有提高医生的免疫组化诊断水平才能避免错误的判断，才能确保免疫组化诊断的准确性。病理技术人员是免疫组化实验成功的关键因素，操作人员要有丰富的免疫组化的理论知识及熟练的免疫组化染色技术，十分清楚每一个步骤的应用原理，使实验结果更具可靠性。可靠的实验试剂和实验方法是每个实验室的必备条件。由于实验方法多种多样，抗体的品种繁多，每个实验室都应当确保高质量高效价的试剂，并摸索出最佳的实验条件。优质的免疫组化取决于有效的抗原修复、敏感的检测系统、合适的实验质控对照及熟练和有责任心的技术人员。
2．固定：在众多的组织固定液中(如甲醛、乙醇、戊二醛、多聚甲醛 等)，不同的实验方法在使用上各有千秋。但在保持组织细胞结构的完整性、抗原可测定性、组织渗透性以及试剂的价格上，福尔马林是最好、既经济又通用。而含酸或含汞的固定液对抗原保存均不理想。组织离体后固定一般不要超过30分钟，在常温条件下固定时间为8-24小时。同时还要注意避免福尔马林过度固定造成的组织抗原丢失，有研究发现新鲜组织经过福尔马林一周固定后组织抗原丢失严重，抗原几乎不能被检测，因为组织固定后会引起蛋白或蛋白分子之间形成交联，导致抗原位点遮盖，可以通过抗原修复方法来修正，若加抗体前不采用抗原修复，则免疫组化染色常不能到达理想结果或不成功。组织同样不能长时间放置在70%的乙醇中，酒精固定后的组织形态不如福尔马林固定的组织。脱钙液对抗原破坏较为严重，因此在组织脱钙前最好在福尔马林液中固定48小时，若组织没有固定透则酸会破坏抗原，脱钙液中酸的浓度与脱钙时间都必须尽量控制在最低的限度。
5．抗原热修复注意事项：无论哪一步都不要让切片干凅，加热后需要冷却15－30分钟。充分的抗原修复是影响染色结果的唯一重要因素，加热的温度和时间可导致修复不足或过度修复。
6．抗原热修复对组织中内源性生物素的影响：抗原热修复在增强抗原决定簇表达的同时，也增强了组织中内源性生物素的反应。采用卵白素-生物素(Avidin-biotin)检测系统，组织中内源性生物素容易出现人为假象，在加热抗原处理条件完全相同的阴性对照片中可以观察到较强的内源性生物素的反应，没有经过热抗原处理的切片中没有出现类似的情况。在细胞浆中呈均一的细颗粒状的浅棕色阳性，有时表达也非常强，与真阳性的结果表达很相似，在以往的免疫组化染色中内源性生物素的影响对诊断造成许多的误差，却常常被忽略。值得提醒的是在概念上一定要十分清楚，阴性对照片必须与一抗的抗原修复处理条件完全相同，才能准确发现内源性生物素出现的部位。
8．脱蜡：免疫组化的脱蜡步骤与常规H&E脱蜡步骤相同，免疫组化实验室中脱蜡需与H&E常规脱蜡分离，以保证脱蜡彻底，否则可能导致染色结果的异常。
三、免疫组化实验中的抗原修复
1．酶消化：如胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白水解酶
2．抗原热修复：高压法、微波法、水煮法
众所周知，免疫组化染色中最关键的莫过于抗原修复，而绝大多数常用抗体的修复是通过加热来完成的，热抗原修复优于酶消化，更有效，染色结果更易一致，操作单一。
3．修复时间：既要获得最强的染色结果，又要保持组织形态的完整性。许多抗原修复存在的问题是组织固定时间过短时，强烈的抗原修复可引起形态破坏、脱片及组织完全消化，解决的方法可采用较短时间的热修复或减少酶的消化时间。
4．抗原修复缓冲液：有柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)、 Tris (pH7-8)、EDTA(pH8.0～9.0) 、 EGTA(pH9.0) 等，柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)的优点是染色背景清晰，适合于大多数抗体，Tris和 EDTA两种修复液对部分抗原修复效果较强，但其染色背景同时加深，如使用不当易造成假阳性结果的判断。目前还没有一种抗原修复液能适合于所有的抗体，柠檬酸缓冲液(pH6.0)可作为免疫组化常规使用的抗原修复缓冲液，但也不能除外某些抗体适用于EDTA和EGTA缓冲修复液，一般抗原比较难于表达的抗体多选择高pH值的修复液。例如：ER、PR、Bcl-2、Bcl-6、TdT、Ki-67、Cyclin D1等。
1．阳性对照:选用已知染色中度阳性以上的组织切片染色，阳性切片应呈阳性，此外组织中的内对照也是很好的阳性对照。
2．阴性对照:选用已知染色阴性的组织切片染色，其结果应为阴性。每次实验中增加Vimentin染色作为对照，目的是观察组织经福尔马林固定后预期抗原表达的敏感性，按福尔马林固定后抗原损伤的程度来进行分析。Vimentin几乎在任何组织中都有表达，尤其适合活检组织中的免疫组化染色观察。在与上皮组织相连接的间质中存在着大量的血管Vimentin可阳性表达，如果在同一张切片的间质中出现Vimentin染色微弱或部分区域变弱的情况，表明是不当的固定导致抗原破坏。所以在每批次实验中应常规加入Vimentin染色，用于指导观察福尔马林固定后抗原表达敏感性情况。
二、免疫组化染色前处理技术操作规范
1．取材：理想的取材厚度是0.2cm～0.3cm，大多数实验室都认为组织在加热抗原修复过程中造成脱片的主要原因是取材过厚或脱水浸蜡处理不当所致。良好的取材、固定、脱水过程是免疫组化质控的前提，如果H&E切片都做不出满意的染色结果，那么免疫组化染色也将无从谈起，根本无法保证染色质量。
(3)细胞核：如Ki-67、ER、PR、TTF-1、HPV-Ag、Cyclin D1、TDT等。
2．组织的周边、气泡、刀痕、皱折等部位往往呈现非特异性阳性表达。
3．染色结果呈阴性并非都是抗原不表达，要考虑是否与组织中的抗原受到破坏有关。
4．组织切片背景深与下列因素有关：
(1)石蜡切片脱蜡不干净；
Nestin、PDGFR 可用于胃肠间质瘤的诊断指标，尤其对CD117阴性胃肠间质瘤在诊断上有很大的帮助，在国外已有文献报导。这两种抗体可用于常规固定的石蜡切片，经实验证明Nestin 用PH8.0 EDTA高压修复，PDGFR用PH6.0 柠檬酸微波修复效果较好。
4．抗体使用：已有大量的即用型抗体供实验室使用，厂家已进行过多次的实验检测，可按厂家提供的条件进行操作。浓缩型抗体一般按照厂家提供的建议稀释度，进行对倍稀释预实验。选定最佳的稀释滴度后再进行批量实验。染色背景深大多是抗体浓度过高所致。抗体孵育温度一般以常温25℃为基准或37℃30分钟，也可4℃冰箱过夜。
6．烤片：切片在60℃～65℃烤箱中烤片30－60分钟左右。有些实验室采用烤片过夜。有报导烤片温度超过60℃时，烤片时间超过18小时的切片，免疫组化染色强度比烤4小时的切片要略弱。温度过高或时间过长均会影响抗原的活性，原因是在高温干燥条件下可以加速组织切片中抗原的氧化。
7．切片保存：一些实验室研究人员习惯将组织蜡块连续切片后长期保存在室温条件下，切片后的组织在室温下长期保存抗原可以损失。迈新实验室在实验中发现蜡块切片后，在室温下保存三个月以上，免疫组化染色结果会出现减弱或阴性情况。并进行了新、旧切片的保存时间对照实验，选择11种不同组织蜡块每例连续切片10片，共110片，常温空气中放置一个月、三个月、半年、一年与新切片进行成对对照实验。实验结果表明：组织蜡块切片后在室温下保存三个月，抗原对多数抗体的敏感性约下降一半，部分切片丢失更多。切片保存半年多数的抗体不能出现阳性标记结果，保存一年以上仅有个别的切片能够有微弱的阳性表达，尤其核表达的抗原丢失更为突出。国外也有类似的资料报道。其原因可能与空气中的氧化作用有关，所以在实际工作可以采用蜡封切片来避免抗原损失以便长期保存，也可4℃冰箱冷藏保存，尤其是用于科研集中实验的切片更应注意切片的保存。
(2)第一抗体浓度过高或孵育时间过长，温度过高；
(3)显色剂DAB浓度过高或H2O2太多；
(4)抗体不纯；
(5)抗体孵育后切片清洗不干净。
六、免疫组化实验对照
为证实抗体和检测试剂盒效价是否可靠，染色操作是否正确，一般需要进行实验对照，以避免试剂失效或操作失当而出现假阴性和假阳性，确保染色结果的可靠性。
七、抗体的保存和稀释
一般来说，抗体应放在4℃冰箱中保存，第一抗体可分成小包装于-20℃保存，使用时存放在4℃，不宜反复存放于4℃和-20℃之间，反复冻融会使抗体效价下跌。检测系统一般不宜于-20℃保存，因为反复冻融使得与抗体结合的酶容易分解，导致检测的敏感度降低。浓缩的抗体在染色前应根据说明书要求或自行摸索出的最佳工作浓度进行稀释。可将抗体稀释至1：10，染色前再稀释成工作液。浓缩液抗体保存的时间较长，反之稀释后的抗体保存的期限较短，如使用即用型抗体，经过一定时间后应注意其效价时否有所降低，避免出现假阴性染色。
7．内源性生物素封闭方法：一般在抗原修复以后，加抗体前使用卵白素进行生物素阻断处理，也可使用非生物素的检测系统，如：EliVision、EnVision、SuperVesion等。
四、免疫组化染色实验操作规范
1．脱蜡：二甲苯 ――→ 酒精 ――→ 蒸馏水
3．血清封闭：在加入一抗前需用二抗的正常血清进行封闭，可以减少非特异性结合。目前使用的二步法检测系统可以免去这一步骤。
7．显色系统：由于检测系统采用的是辣根过氧化物酶，因此选择DAB(棕色)和AEC(红色)作为酶的底物，若采用碱性磷酸酶系统则选择BCIP/NBT(蓝紫色),常规免疫组化显色首选的仍然是DAB，定位清晰，易于保存。AEC不能耐受酒精及敏感性低，BCIP/NBT阳性虽鲜艳，但阳性定位不准确。
8．复染：衬染步骤十分简单，但衬染的好坏对染色最终结果的质量影响很大。有的选用Harris苏木素，有的用Mayer’s苏木素，且与DAB染色对照效果最好，在绝大多数实验室中使用简单方便。也有实验室使用甲基绿衬染衬染，但不能经有机溶剂，容易退色。