最新组培实验外植体选择处理及接种培养知识讲解
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
中浸15-20s，再用无菌水冲洗数次。
（3）玻璃器皿的灭菌 • 湿热灭菌法——即将玻璃器皿包扎后置入蒸汽灭菌锅中进
行高温高压灭菌，灭菌时间可延长达25min—30min。 • 干热灭菌法——即将玻璃器皿置入电热烘箱中进行灭菌。 • 煮沸灭菌——即将玻璃器皿放入水中煮沸进行灭菌。
（4）金属器械的灭菌 火焰灭菌法：即把金属器械放在95%的酒 精中浸一下，然后放在火焰上燃烧灭菌。 这一步骤应当在无菌操作过程中反复进 行。 干热灭菌法：即将拭净或烘干的金属器械用 纸包好，盛在金属盒内，放在烘箱中灭菌。
②对易污染而难灭菌的材料用多种药液交替浸泡消毒： • 一是将外植体用洗涤液充分洗净并修整干净； • 二是将材料放入75%洒精中灭菌30-60s； • 三是在1：500的Roccal B（一种商品灭菌剂名）稀释液中
浸5min； • 四是在2.5%次氯酸钠溶液中灭菌20—30min； • 五是用无菌水冲洗5次，或放入无菌的0.1mol盐酸（HCl）
超净工作台的过滤装置失效 培养用器皿的口径过大 为了减少损失，提高工作效率，必须在每个操作环节注意防 止污染的发生。
• 2.污Hale Waihona Puke Baidu的预防措施
• 发现污染的材料应及时处理，否则将导致培养室环境污染。 对一些特别宝贵的材料，可以取出再次进行更为严格的灭 菌，然后接入新鲜的培养基中重新培养。要处理的污染培 养瓶最好在打开瓶盖前，先集中进行高压灭菌，再清除污 染物，然后洗净备用。现就根据污染途径，阐述污染的几 种预防措施。
常规的表面灭菌处理方法 ①把材料放进75%的酒精中约30～ 60s。 ②用2.5%的CaCl0（次氯酸钙）溶液浸泡15～20min。 ③无菌蒸馏水冲洗3～5次。 ④灭菌时进行摇动，使植物材料与灭菌剂有良好的接触。 ⑤在灭菌剂里滴入数滴0.1%的Tween20（吐温）或Tween80湿润 剂，能增强灭菌效果。
• （5）布质制品的灭菌 • 湿热灭菌法：工作服、口罩、帽子等布质品均用湿
热灭菌法，即将洗净晾干的的布质品，放入高压锅 中，用1.1公斤/厘米2 （即15磅/英寸2），121C的 温度，灭菌20 min～30min。
4.选取适宜的大小 建立无菌材料时，取材的大小根据不同植物材料而异 。材料太大易污染，也不需要；材料太小，多形成愈伤组 织，甚至难于成活。一般选取培养材料的大小，在0.5cm-1.0cm。如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小。
(二)外植体的处理 外植体在接种前先要灭菌，在灭菌前，又先要进行预处 理。植物材料一般采取的预处理方法是，先对植物组织进行 修整，去掉不需要的部分，将准备使用的植物材料在流水中 冲洗干净。经过预处理的植物材料，其表面仍有很多细菌和 真菌，因此还需进一步灭菌。
2. 选择健壮的植株 组织培养用的材料，最好从生长健壮的无病虫的植株 上，选取发育正常的器官或组织。因为这些器官或组织代 谢旺盛，再生能力强，比较容易培养成功。
3.选择最适的时期 组织培养选择材料时，要注意植物的生长季节和植物 的生长发育阶段。如快速繁殖时应在植株生长的最适时期 取材，这样不仅成活率高，而且生长速度快，增殖率高； 花药培养应在花粉发育到单核期时取材，这时比较容易形 成愈伤组织。
（1）防止材料带菌
①用茎尖作外植体时，可在室内或无菌条件下对枝条先进行预 培养。枝条水洗净插入无糖的营养液或自来水促使抽枝，以这 种新抽的嫩枝条作为外植体接种。这样便可大大减少材料的污 染。
或在无菌条件下对采自田间的枝条进行暗培养，待抽出徒 长的黄化枝条时采枝，经灭菌后接种也可明显减少污染。
②选择合适的时间去田间采取外植体
常用灭菌药剂的使用和效果
灭菌剂
次氯酸钠 次氯酸钙 漂白粉 氯化汞 酒精 过氧化氢 溴水 硝酸银 抗菌素
使用浓度（%）
2—3 2
饱和浓度 0.1—1 70—75 10—12 1—2
1 4—50mg/L
清除的难易
易 易 易 较难 易 最易 易 较难 中
消毒时间 效 果
5—30 5—30 5—30 2—10 0.2—2 5—15 2—10 5—30 30—60
细菌污染的特点：菌斑呈粘液状物，而且在接种后1～2天即 可发现。 原因：材料带菌
培养基灭菌不彻底 操作人员未遵守操作规程 因此接种人员的手应经常用70%洒精擦净，镊子和接种针在使 用前必须在火焰上烧红。
真菌污染的特点：污染部分长有不同颜色的霉菌，在接种后 3～10天才能发现。 原因：周围环境不清洁
• 避免阴雨天去田间采取外植体。 • 在晴天采取外植体时，下午采取的外植体要比早晨采的污染
少，因材料经过日晒后可杀死部分细菌或真菌。
• 目前对材料内部污染还没有令人满意的灭菌方法。 在菌类长入组织内部时，要剥去上年生的鳞片， 甚至要除去韧皮组织，只接种内部的分生组织， 以收到一定的防污染效果。
（2）外植体的灭菌 ①多次灭菌法：一是将切好的外植体放入2.5%的次氯酸盐溶 液中消毒20-30min；二是在无菌蒸馏水中冲洗3次；三是将材 料封闭在无菌的培养皿中过夜，保持一定温度；四是第二天 再将外植体用2.5%次氯酸钠灭菌20-30min，然后用蒸馏水洗3 次。对层积过的种子可用多次灭菌法，在种子吸胀前后都要 灭菌。
组培实验外植体选择处理 及接种培养
一、外植体的选择与处理
（一） 外植体的选择 （二） 外植体的处理 （三）污染问题及解决措施
（一）外植体的选择 植物组织培养的主要作业大致包括：外植体的选择与
处理、培养基的制备、器具的消毒、无菌操作和环境条件 的调控。
1. 选择优良的种质 无论是离体培养繁殖种苗，或者是进行生物技术研究， 培养材料的选择都要从主要的植物入手，选取性状优良的 种质，或特殊的基因型。对材料的选择要有明确的目的， 具有一定的代表性，提高成功机率，增加其实用价值。
很好 很好 很好 最好
好 好 很好 好 较好
（三）污染问题及解决措施 1. 污染的原因 污染——是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌， 导致培养失败的现象。 污染的原因：从病源菌方面来分析主要有细菌及真菌两大类； 从污染的途径而言，主要是由于外植体带菌、培养基及器皿灭 菌不彻底、操作人员未遵守操作规程等引起的。
（3）玻璃器皿的灭菌 • 湿热灭菌法——即将玻璃器皿包扎后置入蒸汽灭菌锅中进
行高温高压灭菌，灭菌时间可延长达25min—30min。 • 干热灭菌法——即将玻璃器皿置入电热烘箱中进行灭菌。 • 煮沸灭菌——即将玻璃器皿放入水中煮沸进行灭菌。
（4）金属器械的灭菌 火焰灭菌法：即把金属器械放在95%的酒 精中浸一下，然后放在火焰上燃烧灭菌。 这一步骤应当在无菌操作过程中反复进 行。 干热灭菌法：即将拭净或烘干的金属器械用 纸包好，盛在金属盒内，放在烘箱中灭菌。
②对易污染而难灭菌的材料用多种药液交替浸泡消毒： • 一是将外植体用洗涤液充分洗净并修整干净； • 二是将材料放入75%洒精中灭菌30-60s； • 三是在1：500的Roccal B（一种商品灭菌剂名）稀释液中
浸5min； • 四是在2.5%次氯酸钠溶液中灭菌20—30min； • 五是用无菌水冲洗5次，或放入无菌的0.1mol盐酸（HCl）
超净工作台的过滤装置失效 培养用器皿的口径过大 为了减少损失，提高工作效率，必须在每个操作环节注意防 止污染的发生。
• 2.污Hale Waihona Puke Baidu的预防措施
• 发现污染的材料应及时处理，否则将导致培养室环境污染。 对一些特别宝贵的材料，可以取出再次进行更为严格的灭 菌，然后接入新鲜的培养基中重新培养。要处理的污染培 养瓶最好在打开瓶盖前，先集中进行高压灭菌，再清除污 染物，然后洗净备用。现就根据污染途径，阐述污染的几 种预防措施。
常规的表面灭菌处理方法 ①把材料放进75%的酒精中约30～ 60s。 ②用2.5%的CaCl0（次氯酸钙）溶液浸泡15～20min。 ③无菌蒸馏水冲洗3～5次。 ④灭菌时进行摇动，使植物材料与灭菌剂有良好的接触。 ⑤在灭菌剂里滴入数滴0.1%的Tween20（吐温）或Tween80湿润 剂，能增强灭菌效果。
• （5）布质制品的灭菌 • 湿热灭菌法：工作服、口罩、帽子等布质品均用湿
热灭菌法，即将洗净晾干的的布质品，放入高压锅 中，用1.1公斤/厘米2 （即15磅/英寸2），121C的 温度，灭菌20 min～30min。
4.选取适宜的大小 建立无菌材料时，取材的大小根据不同植物材料而异 。材料太大易污染，也不需要；材料太小，多形成愈伤组 织，甚至难于成活。一般选取培养材料的大小，在0.5cm-1.0cm。如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小。
(二)外植体的处理 外植体在接种前先要灭菌，在灭菌前，又先要进行预处 理。植物材料一般采取的预处理方法是，先对植物组织进行 修整，去掉不需要的部分，将准备使用的植物材料在流水中 冲洗干净。经过预处理的植物材料，其表面仍有很多细菌和 真菌，因此还需进一步灭菌。
2. 选择健壮的植株 组织培养用的材料，最好从生长健壮的无病虫的植株 上，选取发育正常的器官或组织。因为这些器官或组织代 谢旺盛，再生能力强，比较容易培养成功。
3.选择最适的时期 组织培养选择材料时，要注意植物的生长季节和植物 的生长发育阶段。如快速繁殖时应在植株生长的最适时期 取材，这样不仅成活率高，而且生长速度快，增殖率高； 花药培养应在花粉发育到单核期时取材，这时比较容易形 成愈伤组织。
（1）防止材料带菌
①用茎尖作外植体时，可在室内或无菌条件下对枝条先进行预 培养。枝条水洗净插入无糖的营养液或自来水促使抽枝，以这 种新抽的嫩枝条作为外植体接种。这样便可大大减少材料的污 染。
或在无菌条件下对采自田间的枝条进行暗培养，待抽出徒 长的黄化枝条时采枝，经灭菌后接种也可明显减少污染。
②选择合适的时间去田间采取外植体
常用灭菌药剂的使用和效果
灭菌剂
次氯酸钠 次氯酸钙 漂白粉 氯化汞 酒精 过氧化氢 溴水 硝酸银 抗菌素
使用浓度（%）
2—3 2
饱和浓度 0.1—1 70—75 10—12 1—2
1 4—50mg/L
清除的难易
易 易 易 较难 易 最易 易 较难 中
消毒时间 效 果
5—30 5—30 5—30 2—10 0.2—2 5—15 2—10 5—30 30—60
细菌污染的特点：菌斑呈粘液状物，而且在接种后1～2天即 可发现。 原因：材料带菌
培养基灭菌不彻底 操作人员未遵守操作规程 因此接种人员的手应经常用70%洒精擦净，镊子和接种针在使 用前必须在火焰上烧红。
真菌污染的特点：污染部分长有不同颜色的霉菌，在接种后 3～10天才能发现。 原因：周围环境不清洁
• 避免阴雨天去田间采取外植体。 • 在晴天采取外植体时，下午采取的外植体要比早晨采的污染
少，因材料经过日晒后可杀死部分细菌或真菌。
• 目前对材料内部污染还没有令人满意的灭菌方法。 在菌类长入组织内部时，要剥去上年生的鳞片， 甚至要除去韧皮组织，只接种内部的分生组织， 以收到一定的防污染效果。
（2）外植体的灭菌 ①多次灭菌法：一是将切好的外植体放入2.5%的次氯酸盐溶 液中消毒20-30min；二是在无菌蒸馏水中冲洗3次；三是将材 料封闭在无菌的培养皿中过夜，保持一定温度；四是第二天 再将外植体用2.5%次氯酸钠灭菌20-30min，然后用蒸馏水洗3 次。对层积过的种子可用多次灭菌法，在种子吸胀前后都要 灭菌。
组培实验外植体选择处理 及接种培养
一、外植体的选择与处理
（一） 外植体的选择 （二） 外植体的处理 （三）污染问题及解决措施
（一）外植体的选择 植物组织培养的主要作业大致包括：外植体的选择与
处理、培养基的制备、器具的消毒、无菌操作和环境条件 的调控。
1. 选择优良的种质 无论是离体培养繁殖种苗，或者是进行生物技术研究， 培养材料的选择都要从主要的植物入手，选取性状优良的 种质，或特殊的基因型。对材料的选择要有明确的目的， 具有一定的代表性，提高成功机率，增加其实用价值。
很好 很好 很好 最好
好 好 很好 好 较好
（三）污染问题及解决措施 1. 污染的原因 污染——是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌， 导致培养失败的现象。 污染的原因：从病源菌方面来分析主要有细菌及真菌两大类； 从污染的途径而言，主要是由于外植体带菌、培养基及器皿灭 菌不彻底、操作人员未遵守操作规程等引起的。