微生物的实验

实验一油镜的使用方法与革兰氏染色

实验目的:掌握油镜的使用方法与革兰氏染色的方法

实验原理: 革兰染色法

⑴革兰阳性菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易透入；革兰阴性菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄，脂质含量多，乙醇易透入。

⑵革兰阳性菌等电点（pI 2~3）比革兰阴性菌（pI 4~5）低，在相同pH条件下，革兰阳性菌所带负电荷比革兰阴性菌多，故与带正电荷的结晶紫染料结合较牢固，不易脱色。

⑶革兰阳性菌菌体含大量核糖核酸镁盐，可与碘、结晶紫牢固结合，使已着色的细菌不被乙醇脱色；革兰阴性菌含核糖核酸镁盐很少，故易被脱色。

实验步骤: 1.涂片取洁净载玻片1张，用接种环取1～2环生理盐水放于载玻片上，用灭菌的接种环在固体培养基上挑取少许细菌与盐水混合，涂布成直径１cm左右的菌膜（可视挑取菌落的多少涂片范围相应变化）。若采用液体培养物，可直接取1～2环菌液涂布。接种环须经火焰灭菌方可放回原处，以免造成污染。

2.干燥涂片最好在室温中自然干燥，或将标本接种面向上，置酒精灯火焰高处慢慢烘干，切勿在火焰上烤。

3.固定干燥后的标本面向上迅速通过火焰3次，这样既可杀菌，又能将细菌固定在玻片上，以免玻片上细菌在染色过程中被水冲洗掉。

2.染色

(1)初染：滴加结晶紫染液2～3滴于涂布细菌处，覆盖菌膜，1min后以细水漫过轻洗，将积水甩干。

(2)媒染：滴加卢戈碘液同上，1min后水洗，并将标本片上的积水甩净。

(3)脱色：加95%乙醇数滴于标本片上，轻轻摇晃数秒，斜持玻片使乙醇流掉，再滴加乙醇直至无紫色脱下为止（约30s，灵活掌握时间），细水冲洗，甩干。

(4)复染：滴加石炭酸复红染液，30s～1min后水洗，用吸水纸吸去积水。

3. 镜检

用油镜观察，并判断细菌的染色性。记录实验结果。

4.实验后处理

擦干油镜镜头，整理、清洁显微镜，把显微镜放回原处，把标本片放入消毒缸中。

注意事项: 1.标本片涂的太薄或太厚，菌体分散布不均匀，都可影响染色结果。

2.染液因素，所有染液应防止水分蒸发而影响浓度，特别是卢戈碘液久存或受光作用后易失去媒染作用。脱色用的乙醇以95％浓度为宜，若染瓶密封不严或涂片积水过多，可使乙醇浓度降低而增强脱色能力。

3.选用培养12~18h菌龄的细菌为宜。若菌龄太老，由于菌体死亡常使革兰阳性菌呈阴性反应。

思考题: 革兰染色成败的关键在于什么？

实验二培养基的制备与细菌的生化反应

实验目的: 掌握培养基的制备与细菌生化反应的操作方法

实验原理: （一）靛基质（吲哚Indole）试验

有些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中的色氨酸生成靛基质（吲哚）。吲哚本身无色，不易直接观察，此时加入对二甲基氨基苯甲醛（吲哚试剂），则可相互作用而生成红色的玫瑰吲哚，肉眼即可观察。

（二）甲基红（Methyl red,MR）试验

甲基红是一种指示剂（变色范围为pH4.4（红色）～6.2（黄色），可测定细菌分解葡萄糖后培养基中最终的酸碱度，用以鉴别肠道杆菌。细菌（如大肠杆菌）分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步被分解为甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH值降至4.5以下，加入甲基红指示剂呈红色，为阳性。若细菌分解葡萄糖产酸量少或产生的丙酮酸进一步转化为醇、酮、醛、水等，则培养基的pH值在6.2以上，加入甲基红指示剂呈黄色，为阴性反应，如产气杆菌。

（三）糖发酵试验

细菌含有发酵不同糖类的酶，有些能分解糖（醇）产酸，使指示剂变色；有些能产酸又产气。糖发酵管是将葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇或蔗糖等加入蛋白胨水培养基内，使其最终浓度0.75%-1%，并加入一定量的溴甲酚紫指示剂，制成微量发酵管。接种细菌经37℃孵育后，产酸则使指示剂变为黄色、如有气体形成，在微量管内形成气柱。

实验步骤: 1.培养基制备的基本过程包括条调配成分、溶解、矫正pH、过滤澄清、分装、灭菌、质量检查和保存。

⑴调配成分：按培养基组成准确称取各成分用量，放入锥形瓶或大容量烧瓶中，加一定量蒸馏水，使其充分混合。应注意染料、胆盐和指示剂等应在矫正pH后加入。

⑵溶解：将调配好的混合物在沸水浴或流动蒸汽灭菌器中，使其完全溶解。不可将培养基装在铜铁容器中加热，因培养基中铜含量超过0.3mg/L时，细菌不易生长；含铁量超过

0.14mg/L时可抑制细菌毒素的产生。

⑶矫正pH：一般将培养基的pH调至7.2～7.6左右。经高压灭菌后其pH可发生0.1～0.2变动。若用NaOH矫正，高压灭菌后pH下降0.1～0.2；若用NaCO3矫正，高压灭菌后pH 升高0.1～0.2。

⑷滤过澄清：自配的培养基通常有一些浑浊或沉淀，需滤过澄清后方可使用。液体或半固体培养基常用滤纸过滤，固体培养基在熔化后趁热以绒布或双层纱布加脱脂棉过滤。

⑸分装：①基础培养基：一般分装于锥形瓶灭菌后备用，以便随时分装倾注平板或配制营养培养基等；②琼脂斜面：通常在熔化后分装于试管，量约为试管高度的1/4～1/3，加热后灭菌，趁热摆成斜面，斜面长度约为试管长度的2/3，且保持试管下端有1cm柱高；③半固体培养基：分装量为试管容量的1/4～1/3，加塞灭菌后趁热直立凝固；④琼脂高层培养基：分装量为试管长的2/3（接种厌氧菌用），灭菌后趁热直立凝固；⑤琼脂平板无菌分注：先将灭菌琼脂熔化后冷却至50°C左右，以无菌操作倾注于灭菌平皿内（内径90mm的平皿约13～

15 ml），水平旋转平皿，待琼脂凝固后将平皿翻转，置4°C保存备用。

⑹灭菌：①由耐热物质配制成的培养基（如普通营养琼脂等）常用高压蒸气灭菌，条件为103.43kPa,15~20min;含糖培养基以68.95 kPa,10~15min为宜，以免破坏糖类物质。②不耐高热的物质配制成的培养基，如糖类、明胶和牛乳等常用流通蒸气灭菌，方法是加温80～100°C30 min，每天一次，连续3天。③富含蛋白质的培养基（如含血清）需将基础培养基先行灭菌，再将血清过滤除菌

后混装。

⑺质量检测：需做无菌试验和效果试验。①无菌试验：将灭菌后的培养基置35°C孵育24h,无任何细菌生长为合格；②效果试验：将已知的标准菌株接种于待检培养基中，检查细菌的生长繁殖状况和生化反应是否与预期的结果相符合。

⑻保存：制备好的培养基应注明名称、制作日期，存放于4°C冰箱。

（一）靛基质（吲哚Indole）试验

分别接种大肠杆菌、变形杆菌于2支蛋白胨水培养基中。37℃孵育48h后取出，每管分别沿管壁缓缓加入吲哚试剂2~3滴于液面上，静置数分钟，在两液接触面呈玫瑰色（环状）者为阳性，以“＋”表示。反之，则为阴性。